Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de Jove.
1. IRE de los tumores SQ
- Prepare los materiales necesarios: electroporador de onda cuadrada, interruptor de pie de seguridad, electrodos (matriz de agujas frente a pinzas) y adaptadores. Tenga a mano suturas estériles (4-0 no absorbibles), hisopos con alcohol, cortapelos, crema depilatoria, lubricante para los ojos, gasa de algodón, buprenorfina y anestésicos.
- Esterilice la pinza o los electrodos de la matriz de agujas mediante esterilización por gas. No se recomienda el uso en autoclave. Use un esterilizador de perlas de vidrio para esterilizar los electrodos entre animales.
- Siga los pasos para inducir con éxito la anestesia en ratones una vez que el implante tumoral SQ alcance los 5 mm de diámetro. Brevemente, administrar al ratón receptor 0,05 - 1 mg/kg de buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes de la cirugía. A continuación, anestesiar a los ratones receptores con un 2 - 3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min) utilizando un vaporizador de precisión (u otros agentes anestésicos). Mantenga a los ratones sobre una almohadilla térmica a 37 °C durante todo el procedimiento. Aplique lubricante en los ojos para prevenir la desecación. Pruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejo de sobresalto inicialmente, y confirme la anestesia del plano quirúrgico por la falta de reflejo del pie a un pellizco suave del dedo del pie. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico.
- Coloque el ratón anestesiado de lado para acceder al tumor SQ en el flanco. Retire el vello con una maquinilla y limpie la piel con un hisopo con alcohol.
- Para los tumores SQ, use electrodos de matriz de 2 agujas. Eleve la piel directamente debajo del sitio del tumor con fórceps e inserte los electrodos a través de la piel paralelos al cuerpo, asegurándose de que no penetren en la cavidad peritoneal. Una vez que atraviesen la piel, coloque los electrodos de tal manera que sujeten el tumor.
- Programe el electroporador para que entregue pulsos de 100 μs a una frecuencia de 1 Hz a 1.500 V/cm para un total de 150 pulsos. Administre las pulsaciones con el pedal. Separe cada conjunto de 10 pulsos por 10 s, para permitir la disipación del calor y confirmar la posición correcta de los electrodos.
nota: Sin el uso de agentes paralizantes, los ratones experimentarán contracciones musculares con IRE que pueden causar el desplazamiento de los electrodos a menos que se aseguren manualmente.
- Retire los electrodos después de completar la dosificación, que no debe exceder los 200 s. Registre el voltaje real suministrado, que se muestra en el electroporador. Permita que los ratones se recuperen después de IRE en su jaula de origen con libre acceso a comida y agua. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica para facilitar la recuperación. Controlar los signos vitales como la respiración, la perfusión, etc., durante el proceso de recuperación. Confirme los signos del reflejo de enderezamiento una vez que el ratón se recupere, y luego devuelva la jaula a la carcasa normal. Administrar buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8 - 12 h después de la cirugía, y cada 8 - 12 h después del procedimiento, según sea necesario, para los signos de dolor.
2. IRE de Tumores Ortotópicos
NOTA: La IRE de los tumores ortotópicos implica una segunda cirugía de supervivencia en el mismo ratón, por lo que requiere una aprobación especial de la IACUC local antes de comenzar.
- Prepare los materiales necesarios: autoclave las herramientas quirúrgicas como tijeras, bisturíes, destornilladores de agujas, pinzas puntiagudas y pinzas de punta plana. Mantenga también a mano lo siguiente: suturas estériles (6-0 reabsorbibles y 4-0 no absorbibles), hisopos con alcohol, cortapelos, crema depilatoria, lubricante para ojos, gasa de algodón, solución de povidona yodada al 10%, paños quirúrgicos, almohadillas térmicas, electroporador de onda cuadrada, interruptor de pie de seguridad, electrodos y sus adaptadores, buprenorfina y anestésicos.
- Evaluar el crecimiento tumoral ortotópico de los ratones mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo. Seguimiento del crecimiento del tumor mediante imágenes a partir del día 4 después de la implantación ortotópica, y realización de imágenes dos veces por semana. El día de la toma de imágenes, administrar (inyección intraperitoneal) 30 mg/kg de D-luciferina a un ratón receptor anestesiado (2 - 3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min)) 10 minutos antes de la toma de imágenes. Imagen de la actividad de la luciferasa utilizando el ajuste de luminiscencia sin filtros de emisión para una exposición mínima de 5 s en un generador de imágenes de luminiscencia con etapa calentada sin autofluorescencia y mientras se mantiene la anestesia para los ratones.
nota: Los tumores ortotópicos son ideales para el tratamiento con IRE de 8 a 10 días después de la implantación, cuando los tumores son claramente visibles y aún están confinados al páncreas, como se puede ver en las imágenes de luminiscencia de luciferasa
- Siga los pasos para localizar el tumor implantado. Brevemente, administrar al ratón receptor 0,05 - 1 mg/kg de buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes de la cirugía. Anestesiar a los ratones receptores con 2 - 3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min) utilizando un vaporizador de precisión (u otros agentes anestésicos). Mantenga a los ratones sobre una almohadilla térmica a 37 °C durante todo el procedimiento. Aplique lubricante en los ojos para prevenir la desecación. Pruebe la profundidad de la anestesia por la falta de reflejo de sobresalto inicialmente, y confirme la anestesia del plano quirúrgico por la falta de reflejo del pie a un pellizco suave del dedo del pie. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico. Coloque el mouse boca arriba y gírelo suavemente hacia su lado derecho para que el lado izquierdo del abdomen quede expuesto. Retire el vello abdominal del ratón con crema depilatoria y límpielo con una gasa para asegurarse de que no entre pelo libre en el abdomen después de la incisión. Prepare el abdomen izquierdo para la cirugía utilizando 3 ciclos de povidona yodada al 10% seguidos de toallitas con alcohol para desinfectar la piel. Con un bisturí estéril, haga una incisión transversal u oblicua de 1,5 cm en la piel, 1 cm a la izquierda de la línea media, por debajo de la caja torácica, ligeramente medial al bazo. Luego, extienda la incisión a través de la musculatura abdominal, reflejando la incisión superficial suprayacente. Localice el bazo con pinzas de punta plana y exteriorícelo suavemente desde la cavidad abdominal. Retraiga el bazo con un aplicador de algodón estéril y encuentre la cola del páncreas unida a la parte inferior del bazo. Con pinzas de punta plana, retraiga la cola del páncreas lateralmente. Si el tumor no es fácil de localizar, use pinzas de nariz roma para mover el estómago y el bazo suavemente para identificar el tumor.
- Exteriorizar el tumor con pinzas de nariz roma y capturar el tumor firmemente con los electrodos de platino de la pinza. Entregue los pulsos de electroporación según lo programado en el paso 1.7 utilizando el electroporador de onda cuadrada en conjuntos de 10 pulsos controlados por el interruptor de pie.
- Mantenga el tumor exteriorizado durante al menos 60 s después de la IRE para controlar cualquier signo de hemorragia. Inserte el tumor de nuevo en la cavidad abdominal y cierre la incisión como se describe. Brevemente, cierre la musculatura abdominal con una sutura reabsorbible 6-0 con un punto continuo o interrumpido, y cierre la piel suprayacente con una sutura interrumpida no absorbible 3-0 a 6-0. Suspenda la anestesia en este punto. Permita que el mouse se recupere como se describe en 1.7. Monitoree el mouse hasta que se recupere.
- Monitorizar los efectos de la IRE sobre el crecimiento tumoral utilizando imágenes de luciferasa in vivo según el paso 2.2.
