Cocultivos de esferoides 3D bioimpresos magnéticamente: un método para el cocultivo de células cancerosas y fibroblastos

Resumen

Fuente: Noel P. et al.Preparación y ensayo metabólico de cocultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer de páncreas y fibroblastos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo explica la bioimpresión magnética en 3D de células de cáncer de páncreas y fibroblastos cocultivados. Las células de cáncer de páncreas y las células de fibroblastos pancreáticos activados se cocultivan y magnetizan utilizando un ensamblaje de nanopartículas biocompatibles, para generar esferoides, bajo la influencia de fuerzas magnéticas.

Protocolo

1.Cultivo de esferoides 3D de cáncer de páncreas mediante bioimpresión magnética

1. Utilizando la técnica estándar de cultivo aséptico de tejidos, cultive las células de interés en un matraz T75 hasta una confluencia del 70-80% en un medio de crecimiento adecuado
   nota: Típicamente, se recolectaron 5-7 × 10⁶ células de un matraz T75 confluente al 70-80%. En este estudio se utilizaron dos tipos diferentes de células: Patu8902 (células tumorales pancreáticas) y células PS1 (células estrelladas pancreáticas activadas). Ambas líneas celulares se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1× penicilina-estreptomicina (p/s).
2. Lave las células una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
3. Separe las células de la superficie plástica tripsinizando con 2 mL de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5-10 min a 37 °C. Compruebe si hay desprendimiento de células bajo un microscopio.
4. Desactive la tripsina mediante la adición de 8 mL de medio de crecimiento a las células desprendidas. Evite la tripsinización excesiva, ya que esto puede afectar negativamente la salud/viabilidad de las células.
5. Pipetea las células hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión de una sola célula y contar la densidad de células mediante un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
6. Mientras tanto, equilibre un vial de NS a temperatura ambiente.
7. Calcule la cantidad de celdas necesarias para sembrar el número deseado de esferoides (pocillos) y la alícuota a un nuevo tubo cónico de 15 mL. Por ejemplo, para sembrar una placa completa de 96 pocillos con 5.000 células/pocillo, alícuota de al menos 5,5 × 10⁵ células.
8. Recoja las células centrifugando a 500 x g durante 3 min. Limpie o decante cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células a una concentración de 1,0 x 10⁶ células/mL en un medio de crecimiento. Pipetee suavemente con una punta de pipeta ancha y perforada para evitar el cizallamiento. Por ejemplo, vuelva a suspender 5,5 x 10⁵ células en 550 μl de medio de crecimiento.
9. Magnetice la cantidad deseada de celdas utilizando el NS equilibrado (paso 1.6).
   1. Agregue directamente NS a la suspensión celular en el medio de crecimiento y agite suavemente. Para un marcaje magnético eficiente de las células, utilice 10 μL NS por cada 100 μL de células (resuspendidas a 1 x 10⁶ células/mL).
      nota: Para un experimento típico, etiquete 5,5×10⁵ células Patu8902 en 550 μL con 55 μL NS y 1,1×10⁶ células PS1 en 1100 μL, (por separado) con 110 μL NS.
   2. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces para asegurar la suspensión celular. Transfiera temporalmente la mezcla de celda-NS a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Haga esto por separado para cada tipo de celda que se va a magnetizar. Cubra la placa e incube las células a temperatura ambiente durante 2 h agitándolas suavemente para permitir que el NS se una a la superficie de la célula.
      nota: El cultivo y el ensayo de esferoides a partir de células Patu8902 o PS1 solas, además del cocultivo de esferoides a partir de ambos tipos de células premezcladas antes de la impresión en unidades magnéticas, se lograron con éxito utilizando este método en experimentos independientes. A continuación se describe un método para generar esferoides de cocultivo a partir de células Patu8902 y PS2 en los pasos siguientes.
10. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo las células magnetizadas para mezclar uniformemente y preparar una mezcla maestra que contenga el número de células deseado. Para sembrar esferoides, utilice un total de 15.000 células (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) y ajuste a un volumen total de 150 μL por pocillo de una placa de 96 pocillos.
    nota: El volumen final dispensado en cada pocillo debe ser el mismo independientemente del número de celdas utilizadas.
11. Coloque una placa repelente de células de 96 pocillos encima de la unidad de esferoide magnético de 96 pocillos y dispense 150 μL de mezcla de células en cada pocillo. Observe cómo las células se acumulan lentamente en el centro del pozo por encima del imán. Cubra e incube la placa durante la noche en una incubadora de CO₂ al 5% configurada a 37 °C con el accionamiento de esferoide magnético aún conectado. Retire la unidad magnética e incube para un mayor crecimiento durante un máximo de 7 días.
    nota: Es fundamental utilizar placas de crecimiento repelentes de células para la impresión de esferoides mediante accionamientos magnéticos de esferoides. Asegúrese de que se utilice la unidad de esferoide con imanes más delgados y pequeños, no la unidad de retención.
12. Controle el crecimiento de los esferoides todos los días. Rellene con medios de crecimiento nuevos cada tres días colocando la placa de crecimiento montada en la unidad de retención magnética en ángulo y utilizando una pipeta multicanal para extraer los medios gastados.
    nota: Las células Patu8902 y PS1 sembradas conjuntamente a 15.000 células/pocillo se convertirán en esferoides 3D con un diámetro de 400-600 μm en un plazo de 5-7 días. En este punto, los esferoides están listos para la caracterización metabólica, la evaluación de fármacos y otras aplicaciones posteriores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina EDTA	sigma	25300-054
Placa repelente de celdas de 96 pocillos	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	placa de crecimiento esferoide
Celometría Portaobjetos de recuento de células	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Unidad de esferoide magnético n3D	Biociencia Nano3D	655841	Parte del kit de bioimpresión de esferoides
n3D Esferoide magnético holding conducir	Biociencia Nano3D	655841	Parte del kit de bioimpresión de esferoides
n3D NanoShuttle-PL	Biociencia Nano3D	655841	Parte del kit de bioimpresión de esferoides: almacenar a 4 °C
Células Patu8902	Stock de laboratorio		adenocarcinoma ductal pancreático células
Células PS1	Stock de laboratorio		Células estrelladas pancreáticas activadas
RPMI1640	Gibco	11875-093	medios de crecimiento para células, esferoides