1. Ensayo metabólico de esferoides tumorales pancreáticos en 3D para vías bioenergéticas utilizando el analizador de flujo extracelular
NOTA: En esta sección, se describe el análisis de las funciones metabólicas de los esferoides utilizando un analizador de flujo extracelular con microplacas de ensayo diseñadas específicamente para esferoides 3D.
- Lavado y transferencia de esferoides de las placas de crecimiento a las microplacas de ensayo de esferoides.
nota: Los esferoides se pueden utilizar para ensayos metabólicos cuando alcanzan un diámetro de ~500 μm.
- El día anterior a la realización del ensayo, hidratar la sonda o el cartucho del sensor con el calibrante del ensayo (200 μL/pocillo) en la placa utilitaria suministrada e incubar durante la noche (4-18 h) en una incubadora humidificada (sin CO2) ajustada a 37 °C.
- Prepare el medio de ensayo adecuado para el ensayo metabólico deseado complementando el medio base (consulte la Tabla de materiales) con 2 mM de L-glutamina para el ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis (GST) o con 1 mM de piruvato, 2 mM de L-glutamina y 10 mM de glucosa para un ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial (MST)
nota: El analizador de flujo extracelular mide tanto la respiración mitocondrial (OCR) como la glucólisis (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 96 pocillos. Estas tasas proporcionan una visión general de la función metabólica celular en las muestras bajo investigación. Consulte el manual de los kits de ensayo para obtener instrucciones detalladas.
- Después de añadir suplementos específicos del ensayo (consulte el paso 1.1.1), caliente el medio de ensayo suplementado en un baño de agua a 37 °C y ajuste el pH a 7,4 ± 0,1 con NaOH 0,1N. Mantenga el medio caliente hasta su uso.
- Reconstituya los reactivos del kit de ensayo en el medio de ensayo calibrado hasta las concentraciones de stock recomendadas.
nota: Estos se elaboran al 10× de la concentración final deseada en los pozos. Las concentraciones de glucosa, oligomicina y 2-desoxiglucosa (2-DG) son de 100 mM, 100 μM y 500 mM, respectivamente.
- Observe los esferoides en la placa de crecimiento bajo un microscopio óptico para verificar la morfología de los esferoides y la uniformidad general, en términos de la forma y estructura de los esferoides.
- Transfiera la placa de crecimiento a una unidad de retención magnética y aspire cuidadosamente el medio de crecimiento de ~ 120 μL. Lave suavemente los esferoides con ~120 μL de medios de ensayo calentados y precalibrados, aspire y repita el lavado dos veces. Inspeccione los esferoides bajo el microscopio nuevamente para asegurarse de que los esferoides no se laven.
- Prepare la microplaca de ensayo esferoide añadiendo 180 μL de medio de ensayo caliente a cada pocillo.
- Ajuste una micropipeta P20 a 10 μL y colóquele una punta ancha y perforada. Si no dispone de puntas anchas de orificio, corte las puntas de las pipetas normales con unas tijeras limpias o un bisturí para ensanchar el orificio.
nota: Esto debería reducir el cizallamiento y preservar la morfología general de los esferoides mientras se transfieren a las placas de ensayo.
- Utilice una superficie cálida (37 °C) para llevar a cabo la transferencia de esferoides. Utilice una superficie de visor de película de rayos X calentada con una lámpara de luz blanca para mejorar el contraste y ayudar a la visualización de los esferoides durante el proceso de transferencia.
- Aspire cuidadosamente un solo esferoide prelavado de la placa de crecimiento repelente de células utilizando una micropipeta P20 equipada con una punta de diámetro ancho y transfiera suavemente el esferoide directamente al centro de cada pocillo de una placa de ensayo de esferoide para llevar a cabo el ensayo metabólico. Permita que cada esferoide caiga suavemente en la microcámara central de cada pocillo por pura gravedad para llenar la placa de ensayo.
nota: Por lo general, cada esferoide tarda entre 5 y 8 segundos en caer en el centro del pozo por gravedad. No extraiga la pipeta hasta que los esferoides se hayan asentado en la microcámara. No deposite esferoides en los 4 pocillos de las esquinas de la placa de ensayo (A1, A12, H1, H12) ya que se utilizarán como pocillos de fondo.
- Monitoree la morfología y la posición de cada esferoide para asegurarse de que cada esferoide esté en el centro de cada pocillo. Si es necesario, vuelva a colocarlo en el centro del pozo aspirando el esferoide con una punta de pipeta de diámetro ancho y la posterior deposición por gravedad.
- Una vez que se hayan transferido todos los esferoides, coloque la placa de ensayo en una incubadora de aire humidificado a 37 °C (sin CO2) durante una hora antes del ensayo.
- Carga del cartucho sensor con compuestos y realización del ensayo
- Prepare 10× reactivos concentrados específicos del ensayo en el medio específico del ensayo descrito en el paso 1.1.2. Por ejemplo, para llevar a cabo el GST, reconstituya la glucosa, la oligomicina y el 2-DG en los volúmenes recomendados a los que se hace referencia en el manual del ensayo. Los ensayos GST y MST se llevaron a cabo utilizando esferoides Patu8902-PS1.
- Oriente correctamente el cartucho del sensor con las filas etiquetadas de la A a la H en el lado izquierdo y coloque una guía de carga en la parte superior del cartucho del sensor. Asegure la correcta carga del puerto deseado orientando la guía de carga de modo que la letra correspondiente al puerto a cargar esté en la esquina superior izquierda.
- Con una pipeta multicanal, dispense los reactivos directamente en los puertos de inyección. Mantenga las guías de carga en su posición con las yemas de los dedos durante todo el procedimiento.
nota: Cada reactivo se inyectará en un puerto recomendado al que se hace referencia en el manual del ensayo. Evite crear burbujas de aire, pero no golpee ninguna parte del cartucho para eliminar las burbujas de aire.
- Retire la guía de carga y colóquela a la altura de los ojos con el cartucho para inspeccionar visualmente los puertos de inyección y obtener una carga uniforme.
- Cree el diseño del ensayo experimental/protocolo de instrumento utilizando el software Wave del controlador de instrumento (en adelante, software de análisis) como se describe en la sección 1.3.
- Diseño y ejecución de ensayos utilizando el software de análisis
- Creación de una plantilla de ensayo para el experimento
- Abra el software de análisis y haga clic en "Plantillas" o elija una plantilla de ensayo existente. Haga doble clic en "Plantilla en blanco".
- Definir grupos experimentales y condiciones.
- Defina estrategias de inyección para los puertos A, B y C. Deje el puerto D vacío.
nota: Para el ensayo GST, solo estos puertos se cargarán con glucosa, oligomicina y 2-DG. En el caso del ensayo MST, se cargará oligomicina, FCCP y rotenona.
- Defina los pretratamientos si los esferoides se trataron con uno o más compuestos de prueba y el grupo de control. Defina los medios de ensayo para incluir la fuente, los suplementos y otra información.
- Defina uno o más tipos de celda (por ejemplo, Patu8902, PS1) viendo la información de densidad y número de paso.
- Haga clic en "Generar grupos".
- Haga clic en la pestaña "Mapa de placas" y asigne grupos a la placa de ensayo correspondiente al diseño experimental.
- Seleccione los cuatro pozos de las esquinas como pozos de fondo. Asegúrese de que no haya esferoides en estos pozos.
- Ejecutar el ensayo en el analizador
- Haga clic en la pestaña Protocolo del instrumento. Mantenga los comandos de protocolo predeterminados marcando "Calibrar", "Equilibrar" y "Ciclo de medición de referencia".
- Haga clic en "Inyecciones" y defina el compuesto para cada puerto. Edite los ciclos de medición a 6 ciclos desde los 3 ciclos predeterminados para los esferoides. Mantenga los tiempos de mezcla predeterminados de 3 minutos, 0 minutos de espera y 3 minutos de medición.
nota: Los tiempos predeterminados de mezcla-espera-medición son 3 min, 0 min, 3 min, respectivamente. Por lo general, se toman tres mediciones de la tasa basal antes de la inyección del primer compuesto de ensayo. Estas mediciones se pueden calibrar y reajustar según el diseño experimental.
- Revise el protocolo y el resumen del grupo.
- Guarde la plantilla de diseño de ensayo.
- Proceda a la calibración previa al ensayo una vez que los puertos de inyección se hayan cargado con los sustratos del ensayo. Transfiera el cartucho con la placa de utilidad al analizador de flujo extracelular.
nota: Por lo general, esto se completa en 15-20 minutos y calibra los sensores para realizar mediciones de OCR y ECAR.
- Después de la calibración del cartucho, reemplace la placa de utilidad con la placa de ensayo precalentada que contiene esferoides 3D e inicie el ensayo. Una vez completadas las mediciones, exporte los datos a una hoja de cálculo o a un software gráfico y estadístico para analizar los datos.
