Aislamiento de células madre PDAC: un método para aislar células madre cancerosas de tumores pancreáticos

Resumen

Fuente: Lonardo, E., et al. Estudio de las características de las células madre del cáncer de páncreas para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. J. Vis. Exp. (2015).

Este artículo describe la técnica para aislar células madre de cáncer de páncreas (CSCs) del tejido del adenocarcinoma ductal de páncreas humano (PDAC). Estas CSCs se utilizan para estudiar los efectos funcionales del tratamiento farmacológico sobre la capacidad de autorrenovación in vitro de las CSCs para el desarrollo de tratamientos oncológicos más eficientes.

Protocolo

1. Aislamiento de CSCs de PDAC humanos (Figura 1)

1. En una cabina de bioseguridad estéril, transfiera el tejido PDAC humano a una placa de cultivo de 60 x 15 mm que contenga 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1X. Picar el tumor en pedazos pequeños (1 a 5 mm) con un bisturí estéril y fórceps.
2. Agregue 1 ml de PBS estéril 1X a la placa de cultivo y repita el paso de trituración hasta que el tejido esté completamente disociado, regularmente esto requiere 3-4 rondas. Transfiera la suspensión de tejido (rellene hasta un volumen final de 5 ml con 1X PBS) a un tubo estéril y homogeneícelo mecánicamente con un disociador como gentleMACS.
3. Incubar el tejido homogeneizado con colagenasa (utilizar 2,5 mg/ml de colagenasa en 1X PBS) durante 60 min a 37°C y luego centrifugar durante 5 min a 900 x g. Decantar el sobrenadante y resuspender los pellets celulares en 10 ml de medio completo. Filtrar la suspensión celular a través de un colador de 40 μm y centrífuga durante 5 min a 900 x g.
4. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet con 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (cloruro-amonio-potasio, ACK), e incubar el
5. Vuelva a suspender el pellet en medio CSC, coloque en una placa recubierta de gelatina e incube a 37 °C durante 1 h. Este paso eliminará la mayoría de las células fibroblásticas que se adhieren rápidamente a la placa.
6. Retire la placa de la incubadora y recupere cuidadosamente la suspensión celular y cuantifique el número de células viables (azul de tripán negativo) utilizando un hemocitómetro. Para ello, mezcle suavemente la suspensión y pipetee 20 μl de la suspensión en un tubo Eppendorf. Agregue 20 μl (proporción 1:1) de azul de tripano a las células en el tubo de microcentrífuga y mezcle bien. Pipetear aproximadamente 10 μl de la mezcla en el hemocitómetro.
7. Cuente todas las células claras dentro de los cuatro cuadrantes de las esquinas de la cámara de recuento para el recuento de células viables.
   nota: La viabilidad y el rendimiento de las células pueden variar considerablemente entre los especímenes tumorales. En el caso de las muestras de PDAC, la viabilidad oscila regularmente entre el 45 y el 70%, y las piezas de tejido de una muestra tumoral macroscópica con un diámetro de 3 a 5 mm deberían dar lugar a aproximadamente 5x10⁶ células viables.

Resultados

Figura 1. La metformina se dirige selectivamente a las CSC.
(A) La metformina disminuyó el tamaño de las esferas. Imágenes representativas de esferas obtenidas tras el tratamiento con las dosis indicadas de metformina durante 7 días (panel derecho). Cuantificación del tamaño de la esfera (n≥6) (panel izquierdo), los números indicados en el eje de las abscisas re...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
cámara de recuento/ Hemotómetro	Hausser Scientific Co	3200
Contador y analizador de células CASY para la medición de proliferación y viabilidad	Roche Innovatis	AG CASY Modelo TTC 45,60,150 μm
Disociador GentleMACS	Miltenyi Co	130-093-235
Tubos GentleMACS C	Miltenyi Co	130-093-237
Placas de cultivo de tejidos de 100 mm	Halcón BD	353803
Filtro de células	Halcón BD	352350
Tubo cónico de polipropileno de 15 ml	Halcón BD	352097
Tubo cónico de polipropileno de 50 ml	Halcón BD	352070
Tubos estériles de 1,5 ml	Eppendorf	0030 120.086
Tubos de centrífuga de 50 ml	Corning	430828
Placas de Petri estériles, placas de 10 cm	Corning	353003
Colagenasa tipo IV	Tecnologías de células madre	7909
RPMI Medio 1640	Tecnologías para la vida	11875-085
Solución de penicilina/estreptomicina, 100X	Tecnologías para la vida	SV30010
L-glutamina, 200 mM, 100X	Tecnologías para la vida	25030-081
B27 Suplemento 50x	Tecnologías para la vida	17504-044
Factor básico de crecimiento de fibroblastos	sigma	F0291
Águila Modificada de Dulbecco Mediana/F12	sigma	D8437
Estéril 1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	sigma	D8537
Azul de tripano	Tecnologías para la vida	15250-061
Incubadora con aporte de CO2
Micro tijeras
Pinzas curvas
Pinzas para astillas