Ensayo de formación de esferas: un método in vitro para identificar células madre de cáncer de páncreas y terapias de detección

Resumen

Fuente: Lonardo, E. et al. Estudio de las características de las células madre del cáncer de páncreas para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. J. Vis. Exp.(2015).

Este video muestra el protocolo para desarrollar esferoides de células madre de cáncer de páncreas in vitro. El ensayo puede servir como una herramienta de detección para identificar compuestos que potencialmente se dirigen a las células madre cancerosas.

Protocolo

1.Ensayo y análisis de formación de esferas

1. Ensayo de formación de esferas y tratamiento con metformina
   1. Tome el número requerido de células y agregue el volumen adecuado de medio CSC para preparar una concentración celular de 2.000 células/ml. No mantenga la suspensión de celdas en hielo durante no más de 1 hora y mezcle bien antes de enchapar.
   2. Agregue 500 μl de PBS 1X a la primera y última fila de una placa de 24 pocillos para la humidificación con el fin de ayudar a minimizar la evaporación del medio. Siembre las células en placas de células de fijación ultra baja a una densidad de 2.000 células por pocillo en 1 ml de medio de esfera tumoral (2.000 células/ml).
      nota: El número de células que se usan para los ensayos de formación de esferas tumorales puede variar según el tipo de tumor.
   3. Tratar al menos 4 pocillos con vehículo (control negativo) y 4 pocillos con cada tratamiento asignado, por ejemplo, 3 mM de metformina. Coloque las células en una incubadora ajustada a 37 °C y suministre a las células un 5% de_CO2 durante una semana.
      nota: El medio no debe cambiarse para permitir la formación inalterada de esferas tumorales, pero se puede rellenar con factores de crecimiento a diario, ya que no son estables en el medio de cultivo.
   4. Cada dos días agregue tratamiento, por ejemplo, 3 mM de metformina o vehículo a cada uno de los pocillos. Evaluar el número de esferas tumorales formadas después de 5 y/o 7 días mediante el uso de un contador de células automatizado que permite el recuento de estructuras más grandes (Figura 1)
      nota: Solo se deben considerar las esferas tumorales con al menos 40 μm y se pueden clasificar como pequeñas (40 a 80 μm) o grandes (80 a 120 μm), respectivamente. Los resultados se pueden ilustrar como el porcentaje de esferas tumorales dividido por el número inicial de células sembradas (por ejemplo, 2.000 células).
2. Pase en serie de esferas tumorales de primera generación
   1. Después de 7 días de incubación, recoja las esferas tumorales con un filtro de células de 40 μm y centrifuérrelas durante 5 min a 900 x g en RT.
   2. Disocie la bolita de las esferas tumorales en células individuales usando tripsina y luego expanda la suspensión de células individuales obtenida nuevamente durante otros 7 días.

Resultados

Figura 1. El tratamiento con metformina inhibe el consumo de oxígeno e induce la producción de ROS. (A) La adición de metformina inhibe el consumo de oxígeno (OCR) de las células derivadas de la esfera. Dos esferas secundarias diferentes de PDAC se trataron con metformina y los cambios en el OCR se midieron mediante análisis de flujo extracelular. La inyección de ro...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de fijación ultrabajas de 24 pocillos	Corning	3474
Estéril 1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	sigma	D8537
Metformina	sigma	D150959-5G
Solución de tripsina, 0,05%	Tecnologías para la vida	25300054
Incubadora con aporte de CO2
Contador y analizador de células CASY para la medición de proliferación y viabilidad	Roche Innovatis	AG CASY Modelo TTC 45,60,150 μm
Cámara de recuento/ Hemocitómetro	Hausser Scientific Co	3200
Tubos de centrífuga de 50 ml	Corning	430828
Tubo cónico de polipropileno de 15 ml	Halcón BD	352097
Tubo cónico de polipropileno de 50 ml	Halcón BD	352070