Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Resonancia magnética
- Aplique la resonancia magnética cuando el tamaño del tumor sea de aproximadamente 5 a 7 mm de diámetro, generalmente 2 ~ 4 semanas después de la implantación de la célula. Utilice un escáner de resonancia magnética dedicado a la obtención de imágenes de animales pequeños o un escáner de resonancia magnética clínico equipado con una bobina especializada para la obtención de imágenes de animales pequeños.
nota: Utilizamos un escáner de resonancia magnética para animales pequeños de 9,4 T con una combinación de un resonador/transmisor de volumen de 1H y un receptor de bobina de superficie (30 mm de diámetro) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Una bobina de superficie proporciona una mejor relación señal-ruido (SNR).
- Prepare un agente de contraste de resonancia magnética a base de gadolinio para inyectar ~0,1 - 0,2 mmol/kg a cada animal en ~0,1 - 0,2 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato).
nota: Utilizamos gadoteridol e inyectamos 0,2 mmol/kg en 0,15 ml de PBS durante un período de 15 segundos (0,1 ml/seg).
- Prepare un tubo de micropolietileno (longitud: 7,62 mm, diámetro interior: 0,28 mm, diámetro exterior: 0,64 mm). Inserte una aguja de 30 G (12,7 mm de longitud) en un extremo del tubo y una aguja de punta roma de 30 G (9,5 mm de longitud) en el otro extremo. Conecte una jeringa de 1 ml que contenga agente de contraste para resonancia magnética a la aguja de punta roma y empuje lentamente la jeringa para llenar todo el tubo con el agente de contraste para resonancia magnética.
- Anestesiar a los animales utilizando ventilación con ~1 - 2% de isoflurano mezclado con oxígeno (2 L/min) durante la preparación y la toma de imágenes. Confirmar la profundidad de la anestesia mediante el reflejo de pellizco de los dedos de los pies. Aplique ungüento oftálmico veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Dilate la vena de la cola con una lámpara de calor antes de la inserción de la aguja. Agarra el centro de la aguja de 30 G con pinzas Kelly e insértala en la vena de la cola. Pega la cola y el tubo en un trozo de plástico o papel de cartón (10 mm de ancho x 100 mm de largo) para mantener la cola recta.
- Coloque al animal en posición supina en una cama equipada con circulación de agua tibia (o aire caliente) para regular la temperatura corporal durante la toma de imágenes. Ajuste la temperatura de la cama a 37 °C. Inserte una sonda de temperatura rectal para controlar la temperatura corporal durante la toma de imágenes.
- Aplique una tabla de plástico doblada ortogonalmente en el área abdominal. Asegúrese de que el tumor esté ubicado detrás del extremo superior de la tabla y luego tire ligeramente hacia abajo (~ 2 mm) para asegurarse de que el tumor sea atrapado por la tabla. Pega firmemente la tabla a la cama del animal.
- Pegue con cinta adhesiva un transductor de almohadilla respiratoria (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) en el área del pecho para monitorear la respiración de los animales durante la toma de imágenes. Coloque una bobina de superficie en la parte superior de la región tumoral y péguela firmemente al lecho del animal. Empuje el lecho del animal en el escáner de resonancia magnética para colocar la región tumoral en el centro de la bobina de volumen (diámetro interior: 72 mm).
- Realice la coincidencia y la sintonización tanto para el receptor como para el transmisor, seguido de la calza.
- Comience con una secuencia anatómica de resonancia magnética para localizar el tumor. Utilice una secuencia de espín-eco turbo ponderada en T2 (T2W) para obtener imágenes axiales con los siguientes parámetros de adquisición. Tiempo de repetición (TR)/tiempo de eco (TE) = 3.000/34 ms, matriz de 128 x 128, campo de visión de 30 x 30 mm, número de promedios = 1, longitud del tren de eco = 4 y 20 cortes contiguos de 1 mm de grosor en modo entrelazado para cubrir toda la región tumoral (tiempo total de exploración: 1,6 min)
nota: Dado que los tumores pancreáticos ortotópicos son más difíciles de localizar que los subcutáneos, es posible que las imágenes de localizador convencionales que tienen una resolución más baja no sean útiles.
- Adquiera imágenes ponderadas en T1 (T1W) con varios ángulos de volteo para recuperar el mapa T1. Para ello, utilice un enfoque de ángulo de eco degradado con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR)/tiempo de eco (TE) = 115/3 mseg, matriz de 128 x 128, un campo de visión de 30 x 30 mm, número de promedios = 4, ~5 - 7 cortes contiguos de 1 mm de grosor en modo entrelazado para cubrir la región tumoral, y siete ángulos de volteo de 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 (tiempo total de escaneo por ángulo de volteo: 1 min).
nota: Sin embargo, el enfoque de ángulo de volteo múltiple es eficiente solo cuando la homogeneidad del campo B1 es alta. De lo contrario, los mapas T1 se pueden obtener con múltiples enfoques TR en su lugar.
- Adquiera imágenes T1W antes y después de la inyección de contraste para resonancia magnética basada en gadolinio. Utilice los mismos parámetros de adquisición y geometría para el mapeo T1 pero con un ángulo de giro fijo de 30. Utilice la codificación lineal para garantizar el estado estable cuando se obtiene el centro del espacio k, especialmente cuando se utiliza un TR corto y un ángulo de giro de grado bajo. Adquiera 5 imágenes de referencia antes de la inyección de contraste. A continuación, adquiera 40 imágenes después de la inyección de contraste (tiempo total de escaneo: 45 min). Utilice una bomba de jeringa para inyectar el agente de contraste a una velocidad constante (0,01 ml/s).
- Controle la respiración de los animales de forma continua y ajuste la concentración de isoflurano para mantener la frecuencia respiratoria entre 50 y 100 respiraciones por minuto.
- Después de completar la DCE-MRI, retire la aguja y otras sondas, y coloque al animal en una jaula vacía cubierta con toallas de papel. Masajee suavemente el área abdominal inferior. La jaula debe colocarse medio debajo de una lámpara de calor para permitir que el animal entre y salga del gradiente de calor a medida que se recupera. No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
