1. Preparación de esferoides tumorales 3D incrustados en ECM
- Prepare una estación de trabajo con los materiales necesarios dentro de una campana de flujo laminar.
- Prepare una mezcla diluida de sondas trazadoras fluorescentes de 1 μm de diámetro modificadas con carboxilato añadiendo 2 partes de sondas de culata (2% de sólidos) a 25 partes de agua estéril.
- Saca un frasco de 3,1 mg/ml de colágeno bovino del frigorífico y colócalo sobre hielo.
- Alícuota 125 μl de colágeno en un vial vacío de 2 ml.
- Añadir 50 μl de solución diluida de sonda trazadora al vial que contiene el colágeno y el vórtice brevemente para distribuir las sondas.
- Añada 235 μl de medio de cultivo celular adecuado que contenga rojo fenol (que se volverá amarillo) para un volumen total de 410 ml y vórtice brevemente antes de extraer 205 ml (la mitad del volumen total) y colocarlo en un nuevo vial de 2 ml. El vial 1 contendrá el esferoide tumoral y el vial 2 será una mezcla de control.
- Agregue ~ 2 μl de NaOH 1 M al vial 1 para que la solución vuelva a tener un pH neutro (los medios de cultivo que contienen rojo de fenol deben volver al rojo). Ten en cuenta que esto hará que la mezcla comience a curarse si no se mantiene en hielo. Agite brevemente para mezclar, luego regrese a la rejilla de hielo inmediatamente.
nota: El esferoide es apenas visible a simple vista después de 9 días de cultivo y su extracción del lecho de agarosa es una tarea delicada. El uso de un microscopio de disección puede ser útil para algunos usuarios. Mantener la integridad del esferoide durante la transferencia es primordial.
- Con una punta de pipeta de boca ancha, extraiga suavemente 40 μl de medio del pocillo que contiene el esferoide tumoral. Conserva estos 40 μl mientras realizas el siguiente paso.
- Revise el pozo para ver si el esferoide se eliminó en el paso anterior. Si es así, agregue los 40 μl que contienen el esferoide al vial 1. De lo contrario, vuelva a colocar los 40 μl en el pocillo y repita el paso anterior.
- Agite suavemente el vial 1 (no corra el riesgo de formar un vórtice, ya que puede dañar el esferoide) antes de transferir la mezcla en porciones de 60 μl a tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccione cada pocillo con un microscopio después de agregar la mezcla para determinar qué pocillo contiene el esferoide.
- Agregue ~ 2 μl 1 M de NaOH y 40 μl de medio de cultivo celular al vial 2 y al vórtice antes de alicuota 60 μl de esta mezcla a un pocillo vacío en la placa de 96 pocillos y marcarlo como control.
- Coloque la placa en una incubadora a 37 °C para curar durante al menos 1 hora.
2. Construya una cuadrícula de puntos de muestra y tome un video en cada punto
- Transfiera la placa de muestra de la incubadora a la platina del microscopio. Espere 10 minutos para que la muestra se equilibre con la temperatura ambiente si no se dispone de una etapa calentada.
- Observe la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que esté intacta y lista para la obtención de imágenes. Determinar la posición del tumor dentro del pocillo.
- Decida cuántos puntos de muestra tomar. Por lo general, 20 puntos de muestreo en cada pocillo, distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide, producirán resultados adecuadamente detallados.
- Mueva la platina a cada posición deseada y utilice el software de interfaz del microscopio para registrar las coordenadas x e y (o registre las coordenadas manualmente si el software de interfaz no está disponible).
- Cambie el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia (normalmente 100X) y seleccione el cubo de filtro adecuado para la longitud de onda de excitación de las sondas trazadoras. Utilice la lista de puntos creada en el paso 2.4 para desplazarse al primer punto de la cuadrícula.
- Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo y, a continuación, muévase hacia arriba para encontrar un campo de visión (fov) que contenga varias sondas trazadoras enfocadas.
- Observe el histograma de intensidad y ajuste la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible y asegurarse de que la imagen no se sature.
- Obtenga una secuencia de vídeo a una velocidad de fotogramas de 20-30 mseg por fotograma (se recomiendan aproximadamente 800 fotogramas o 16-24 seg. de longitud para proporcionar estadísticas suficientes para un cálculo sólido de MSD equilibrado con la necesidad de minimizar el tiempo de adquisición en cada punto de la cuadrícula espacial) y ahorre con una convención adecuada. Durante la grabación, no toque el microscopio ni la mesa.
- Repita los pasos 2.6 a 2.9 para cada punto de muestra de la cuadrícula.
- Repita los pasos 2.3 a 2.10 para cada pocillo del experimento.
