>1. Preparación de cultivos celulares y montaje experimental
- Mantenga las células de cáncer de colon humano, HCT-116 según lo recomendado por el proveedor, en monocapas en frascos de cultivo de75 cm2 que contienen 10 mL de McCoy's 5a Medium Modified formulado, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de solución antibiótica antimicótica.
- Cultivar células en un ambiente humidificado al 5% de CO2 a 37 °C hasta una confluencia del 70% con renovación media cada 2 a 3 días.
- Para obtener el efecto del haz BNCT (por ejemplo, haz de neutrones más BPA) y BNCT de matar las células cancerosas como partículas pesadas y depositar la mayor parte de su energía dentro de las células cancerosas que contienen boro, el día antes de la irradiación, agregue un agente de entrega de boro al medio de cultivo celular, por ejemplo, 10BPA, 4-Borono-L-fenilalanina (10 μg 10B / mL, 0,925 mM final) 12–16 h (máxima absorción de boro) antes de la irradiación.
nota: Si se utiliza otra línea celular, para la que no existen datos en el caso del estudio BNCT, pruebe la absorción de boro de cada línea celular para obtener la concentración óptima de boro. Mida la absorción celular de BPA mediante espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) realizada por el grupo Dagrosa.
- Después de 12-16 h de suministro de boro, aspirar el medio y lavar las células con 10 mL de 1x PBS. A continuación, tripsinice las células añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA a las células e incube durante 5 minutos a 37 °C para mejorar el desprendimiento celular. Cuando las células comiencen a desprenderse, detenga la acción de la tripsina agregando 10 mL de medio completo.
- Aspire la suspensión celular en el tubo de 15 mL y cuente las células usando un contador de células automatizado agregando 10 μL de azul de tripán al 0,4% a 10 μL de células, mezcle y alícuota 10 μL en un portaobjetos de conteo. Diluir la suspensión celular hasta una concentración de 1 x 106 células/mL del medio. Alícuota 1 mL de la suspensión celular por criotubo.
- Prepare dosímetros termoluminiscentes (TLD) para la medición de dosis de rayos gamma y láminas de oro para fluencias de neutrones y conecte TLD a los criotubos o matraz de cultivo celular antes de la irradiación.
- Irradiar 1 x 106 células/mL con el haz de neutrones mezclados al flujo de neutrones térmico mínimo recomendado de 5,9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 en matraces de cultivo o criotubos, dependiendo de las capacidades de la instalación
nota: Configure el tiempo de irradiación antes para obtener el flujo de neutrones recomendado.
- Después de la irradiación, siembre 1 mL de células irradiadas (1 x 106 células/mL) en cubreobjetos de 22 x 22 mm en placas de Petri de 35 mm o placas de 6 pocillos, complemente con 2 mL del medio requerido. Incubar las células durante un máximo de 3 h a 37 °C en un ambiente humidificado con 5% de CO2 para que se adhieran a los cubreobjetos. Observe la unión de las células de vez en cuando bajo un microscopio invertido con un objetivo de 20x.
nota: En el caso de las células HCT-116, la densidad mínima es de 600.000 células por inicialización. Para un procedimiento de tinción adicional rápido, use portaobjetos de cámara, reduzca la densidad celular en consecuencia.
>2. Fijación de células
- Después de la irradiación y la incubación de las células, retire el medio de las células adjuntas y lave las células una vez con 2,5 ml de PBS.
- Fije las celdas con 1 mL de etanol al 70% durante 10 min a RT.
nota: Alternativamente, use 1%-3.7% de paraformaldehído (PFA) para la fijación como se recomendó anteriormente. El protocolo está en pausa aquí. Almacene las células fijas en etanol en un congelador a -20 °C durante no más de unas pocas semanas para su posterior análisis y tinción con inmunofluorescencia.
>3. Permeabilización de las células
- Después de la fijación, retire el etanol de la placa de Petri y lávela con 2,5 mL de 1x PBS.
nota: No deje que las células se sequen entre los pasos de enjuague.
- Agregue suavemente 1 mL de Triton X-100/PBS al 0,2% para cubrir los cubreobjetos con celdas en placas de Petri.
- Incubar durante 5 min en RT.
- Lave las celdas 3 veces con 2,5 mL de 1x PBS.
nota: Aumente el porcentaje de Triton X-100 en PBS hasta un 0,5% si es necesario (más focos detectables, dependiendo de la línea celular probada). Realice lavados adicionales con PBST (PBS con 0,5% de interpolación) para evitar uniones inespecíficas.
- Bloquear la etapa de permeabilización con 1 mL de BSA (albúmina de la fracción V del suero bovino) al 2% diluido en PBS e incubar durante un mínimo de 30 min o 1 h con BSA al 1%
nota: Este paso se puede omitir y depende del tipo de anticuerpo utilizado. Alternativamente, use 5% de FBS como se recomienda.
>4. Tinción de inmunofluorescencia
- Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo primario (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs y Anti-Rad52) diluido en PBS con BSA (2% de albúmina de la fracción V del suero bovino) como se recomienda (ver Tabla 1 con las diluciones recomendadas) (se necesitan 100 μL por muestra).
| Anticuerpo primario | función | Dilución recomendada | Almacenamiento [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | detección de ADN-DSBs | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | detección de RIFs de la proteína DNA-PKcs perteneciente a NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-RAD52 | detección de RIFs de la proteína Rad52 perteneciente a HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anticuerpo secundario | | A oscuras | |
| IgG FITC antiratón | Enfoques ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Cabra Anti-Conejo IgG H&L (Alexa Fluor 488) | para los focos de proteínas de reparación NHEJ y HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabla 1: Diluciones recomendadas y notas para el uso de anticuerpos utilizados en la sección
- Cubra la placa de Petri para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina humectada utilizando agua destilada e incube durante 30 min a 37 °C en la incubadora.
nota: El protocolo se puede pausar aquí. La incubación se puede realizar a 4 °C durante la noche.
- Después de la incubación, realizar 3 lavados con 2,5 mL de PBS.
nota: No permita que el portaobjetos se seque durante los pasos de enjuague.
- Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón FITC, IgG anti-conejo de cabra (Alexa Fluor 488) diluido en PBS con BSA (ver Tabla 1) (se necesitan 100 μL por muestra). Para este y los siguientes pasos, trabaja en la oscuridad.
- Vuelva a tapar la placa de Petri para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina humectada e incube durante un mínimo de 30 min a 37 °C en la incubadora.
- Después de la incubación, realizar 3 lavados con 2,5 mL de PBS.
- Añadir 100 μL de DAPI diluido en PBS hasta una concentración final de 1 μg/mL para contratinción de los núcleos.
- Incubar brevemente durante un máximo de 2 min en RT.
- Después de la incubación, realizar 3 lavados con 2,5 mL de PBS.
- Retire el PBS y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje, evitando la formación de burbujas de aire, y selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Espere hasta que el barniz se seque y pinte el cubreobjetos.
- Espere el endurecimiento del medio de montaje (hasta 3 h) antes del análisis de la imagen bajo microscopía de fluorescencia.
nota: El protocolo se puede pausar aquí. Guarde los portaobjetos de vidrio en una caja de plástico a 4 °C en la oscuridad.
