1. Siembra de células
- Siembre 2 x 105 células de cáncer colorrectal HCT116 por pocillo en una placa de 24 pocillos y mantenga las células en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) durante la noche a 37 °C.
- Sustituya el medio de cultivo por o sin 100 μM de sulfato ferroso (FS) o 10 μM de doxorrubicina (DOX) y cocine durante 24 h.
>2. Preparación de la solución DCFH-DA
- Disuelva 4,85 mg de DCFH-DA en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución madre de 10 mM.
- Diluya la solución madre con DMEM precalentado en una solución de trabajo de 10 μM justo antes de agregarla a los pocillos.
- Vórtice la solución de trabajo durante 10 s.
>3. Tinción de DCFH-DA
- Retire el medio que contiene el medicamento y lávese una vez con DMEM.
- Añadir 500 μL de la solución de trabajo DCFH-DA en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Retire la solución de trabajo DCFH-DA. Lavar una vez con DMEM y 2 veces con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Agregue 500 μL de 1x PBS a cada pocillo.
>4. Adquisición de imágenes y medición de la intensidad
- Tome imágenes fluorescentes representativas de cada pocillo utilizando el canal de proteína fluorescente verde (GFP) en un microscopio de fluorescencia.
- Después de tomar imágenes, retire el PBS y agregue 200 μL de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) a cada pocillo.
- Incubar en hielo durante 5 minutos, luego recoger el lisado celular en tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar a 21.130 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera 100 μL del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos y mida la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
- Transfiera 1 μL del sobrenadante a una placa transparente de 96 pocillos que contenga 100 μL de solución de ensayo de proteína 1x para medir la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford.
- Normalice las intensidades de fluorescencia con concentraciones de proteínas.
