Detección de ROS con tinción DCFH-DA: medición de ROS totales en líneas celulares de cáncer colorrectal

Resumen

Fuente: Kim, H., et al. Detección de especies reactivas totales de oxígeno en células adherentes mediante tinción de diaacetato de 2',7'-diclorodiclorofluoresceína. J. Vis. Exp. (2020).

Este video describe el protocolo para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares totales utilizando diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Este método ayuda a visualizar la localización de las ROS en las células adherentes utilizando un microscopio de fluorescencia y a cuantificar aún más la intensidad de las ROS con un lector de placas de fluorescencia.

Protocolo

1. Siembra de células

1. Siembre 2 x 10^{5 células} de cáncer colorrectal HCT116 por pocillo en una placa de 24 pocillos y mantenga las células en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) durante la noche a 37 °C.
2. Sustituya el medio de cultivo por o sin 100 μM de sulfato ferroso (FS) o 10 μM de doxorrubicina (DOX) y cocine durante 24 h.

>2. Preparación de la solución DCFH-DA

1. Disuelva 4,85 mg de DCFH-DA en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución madre de 10 mM.
2. Diluya la solución madre con DMEM precalentado en una solución de trabajo ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2',7'-Diclorofluoresceína diacetato	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Clorhidrato de doxorrubicina	TCI America, Portland, Oregón	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medio	Corning, Corning, NY	45000-304
Sistema de imagen automático Invitrogen EVOS FL	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	o cualquier otro microscopio de fluorescencia
Ensayo de proteínas solución de Bradford	Bio-Rad, Hércules, CA	5000001
Lector de microplacas SpectraMax M2	Dispositivos moleculares, Radnor, PA	89429-532	o cualquier otro lector de microplacas de fluorescencia
Sulfato ferroso heptahidratado	VWR, Radnor, PA	97061-542