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Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cultivo de líneas celulares
- Cultive células HK en medio RPMI-1640 completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, 2 nM de glutamina, 100 U/mL de penicilina G y 100 mg/mL de estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
nota: Las células HK son células dendríticas foliculares humanas normales y pueden cultivarse y expandirse durante ≤ 15 conductos in vitro.
>2. Marcaje y enriquecimiento de tumores marcados con luciferasa
- Implante tumores directamente en el flanco izquierdo y derecho de ratones hembra NOD/SCID de 6 a 8 semanas de edad.
- Mida el crecimiento del tumor cada dos semanas utilizando un calibrador digital.
- A 1 cm de diámetro, transducir el tumor. Inyectar directamente en el tumor una dosis única de lentivirus Luc/proteína fluorescente roja (RFP)-lentivirus (50 μL/tumor, dilución 1:30 a partir de un stock concentrado de lentivirus de alto título) utilizando una jeringa de 1 cc con una aguja de 27 G.
nota: El tumor del paciente suele alcanzar 1 cm de diámetro en 1-2 meses. Sin embargo, la tasa de crecimiento es extremadamente variable y se basa en una serie de factores, incluido el grado y el tipo de tumor.
3. Modelo de ratón CRC
- Anestesiar a un ratón macho NOD/SCID de seis a ocho semanas de edad con isoflurano (2,5% en oxígeno al 100%, 1 L/min) en la cámara de inducción. Confirme la sedación con un pellizco en el dedo del pie.
- Coloque al ratón anestesiado en posición supina bajo un microscopio de disección, asegurándose de asegurar su hocico a un cono de nariz de isoflurano y sus extremidades delanteras con cinta adhesiva para mayor estabilidad><.
nota: Se pueden usar lupas en lugar de un microscopio de disección. Un objeto pequeño se puede usar para mejorar la visibilidad y el ángulo cuando se coloca debajo de la base de la cola, elevando el ano. Por lo general, pequeñas secciones de gasa se enrollan en forma de cilindro de 1 pulgada de diámetro.
- Dilata el canal anal con pinzas curvas, lubricadas y de punta roma para exponer la mucosa anal y rectal distal. Retira las heces.
- Utilice una aguja extraíble estéril de 30 G en una jeringa de vidrio de 50 μL para inyectar 10 μL de células tumorales marcadas con luciferasa y células HK (resuspender 10 μL de células tumorales por ratón para el modelo de CCR en medios RPMI completos) en la submucosa rectal posterior distal, de 1 a 2 mm por encima del canal anal. El bisel de la aguja debe estar cubierto por mucosa. Tenga cuidado de no pasar a la cavidad pélvica.
- Retire el ratón del cono de la nariz de isoflurano. Obsérvelo durante 1 h siguiendo el procedimiento. Busque signos de angustia, es decir, espalda encorvada, respiración dificultosa, etc.
4. Imágenes bioluminiscentes
- Monitorice semanalmente la carga metastásica del tumor primario, el hígado y el pulmón mediante un sistema de imágenes bioluminiscentes para determinar la actividad de la luciferasa.
- Obtenga un experimento de CRC en ratones y péselo. Inyectar 150 mg/kg de luciferina por vía intraperitoneal y esperar 5 min para que el sustrato circule en el cuerpo del ratón.
- Anestesiar al ratón con isoflurano al 2,5% en oxígeno al 100%, 1 L/min en la cámara de inducción.
- Coloque el ratón en una máquina de imágenes BLI con la nariz fija en el cono de la nariz. Al exponer para una imagen, asegúrese de que el área de interés esté orientada hacia la cámara. Para la inyección de CCR, el lado ventral debe mirar hacia la cámara para cada imagen. Imagina el ratón en posición supina.