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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. La preparación de huA33-TCO
NOTA: La síntesis de huA33-TCO ha sido reportada previamente. Sin embargo, para la facilidad del lector, se replica aquí con ajustes para condiciones óptimas.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 125 μL de (E)-ciclooct-4-enil 2,5-dioxo-1-pirrolidinilo carbonato (TCO-NHS) en dimetilformamida seca (DMF) a una concentración de 40 mg/mL (0,15 M). Esta solución puede ser alícuota y congelada a -80 °C para su uso en futuros experimentos.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL separado, prepare una solución de 5 mg/mL de huA33 en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 2,7 mM de cloruro de potasio, 137 mM de cloruro de sodio y 11,9 mM de fosfato de potasio, pH 7,4).
- Utilizando pequeñas alícuotas (<5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajuste el pH de la solución de anticuerpos del paso 1,2 a 8,8-9,0. Use papel de pH o un medidor de pH con un microelectrodo para monitorear el pH y tenga cuidado de que el pH no exceda 9.0.
- A la solución de anticuerpos descrita en el paso 1.3, agregue lentamente un volumen correspondiente a 40 equivalentes molares de TCO-NHS en relación con la cantidad de anticuerpo. Por ejemplo, si hay 5 mg (30 nmol) de huA33 en la solución, agregue 9,0 μL (1,20 μmol) de la solución de 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
nota: El TCO-NHS es hidrofóbico. Al agregarlo a la solución de anticuerpos, agréguelo lentamente y con agitación para evitar la precipitación. No exceda el 10% de DMF por volumen en la solución de reacción final.
- Deje que la reacción se incube a 25 °C en un termomezclador durante 1 h con agitación suave (500 rpm).
- Después de 1 h, purifique el inmunoconjugado huA33-TCO utilizando una columna desalinizadora de exclusión por tamaño desechable preempaquetada.
- Equilibre la columna de exclusión de tamaño descrita por el proveedor para eliminar los conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento. Un procedimiento típico consiste en lavar la columna 5 veces con un volumen de PBS que corresponde al volumen de la columna: 5 x 2,5 mL de PBS.
- Agregue la mezcla de reacción a la columna de exclusión de tamaño anotando el volumen de la mezcla de reacción.
- Después de que la mezcla de reacción haya entrado en la columna, agregue una cantidad adecuada de PBS para aumentar el volumen total de solución agregada a la columna a 2,5 mL. Por ejemplo, si la reacción de conjugación dio como resultado un volumen total de 1,3 mL, agregue 1,2 mL de PBS adicional a la columna.
- Recoja el producto utilizando 2 mL de PBS como eluyente.
nota: Este paso producirá la construcción final huA33-TCO en 2 mL de PBS, pH 7.4.
- Mida la concentración del huA33-TCO utilizando un espectrofotómetro UV-Vis que monitorea la longitud de onda de 280 nm. El coeficiente de extinción molar para la mayoría de las IgG (ε 280) es de 210.000 M-1 cm-1.
- Si se desea una solución con una mayor concentración de inmunoconjugado, concentre la solución de huA33-TCO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un corte de 50.000 pesos moleculares siguiendo las instrucciones >
nota: Se sabe que muchos anticuerpos se agregan o precipitan durante la concentración. Al intentar este procedimiento con un nuevo anticuerpo, los investigadores deben remitirse a la literatura o a su propia experiencia con el anticuerpo en cuestión.
- Almacene el inmunoconjugado huA33-TCO completado a 4 °C en la oscuridad si es necesario inmediatamente. Si se va a utilizar más de 4 días en el futuro, guárdelo a -80 °C en la oscuridad.
nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El inmunoconjugado huA33-TCO completado debe ser estable durante al menos 6 meses de almacenamiento a -80 °C en la oscuridad.
>2. La síntesis de Tz-PEG 7-NHBoc
- En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, disuelva 5 mg de éster de N-hidroxisuccinimidilo de tetracina (Tz-NHS; 12,6 μmol) en 0,15 mL de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO).
- En un tubo de microcentrífuga separado de 1,7 mL, disuelva 8 mg del polímero amino PEG protegido contra Boc, O-(2-aminoetil)-O'-[2-(Boc-amino)etil]hexaetilenglicol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) en 0,15 mL de DMSO anhidro.
- A la solución de Tz-NHS, añadir 3 μL (21,3 μmol, equivalentes 1,7 molares) de trietilamina (TEA) y mezclar bien.
- Añadir la solución de tetrazina rosa a la solución NHBoc-PEG7-NH 2 del paso 2.2 e incubar la mezcla de reacción durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con agitación suave.
- Después de 30 minutos, diluya la mezcla de reacción 1:1 en H2O y purifique mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) C18 de fase reversa para separar cualquier Tz-NHS no reaccionado del Tz-PEG 7-NHBoc. Utilice disolventes sin ácido para evitar la eliminación prematura del grupo protector Boc. Monitoree Tz-PEG 7-NHBoc y Tz-NHS a una longitud de onda de 525 nm.
nota: Los tiempos de retención dependen en gran medida de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.), y se deben realizar controles adecuados antes de la purificación. Sin embargo, para presentar un ejemplo, si se utiliza un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos sin ningún aditivo) a 95:5 MeCN/H2O durante 30 min, un caudal de 1 mL/min y una columna analítica C18 de 4,6 mm x 250 mm, los tiempos de retención de Tz-NHS y Tz-PEG 7-NHBoc son de alrededor de 16 min y 18 min, respectivamente.
- Congele el eluyente de HPLC recolectado con nitrógeno líquido y envuelva el tubo de recolección ahora congelado en papel de aluminio. Coloque el tubo de recolección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será de un característico color rosa brillante.
nota: Si no dispone de nitrógeno líquido, congele el eluyente de HPLC recogido en hielo seco o durante la noche en un congelador a -80 °C.
>3. La síntesis de Tz-PEG7-NH 2
- Al producto del paso 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, añadir 1,5 mL de diclorometano (DCM) y transferir esta solución a un pequeño matraz de fondo redondo.
- Agregue 0,25 mL de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota a la solución rosa del paso 3.1.
- Deje que la reacción se incube durante 30 min a RT con una agitación leve.
- Después de 30 minutos, evapore el solvente mediante evaporación rotativa. No exceda la temperatura del baño de agua de 37 °C.
- Reconstituir el producto viscoso rosado en 0,5 mL de agua.
- Purifique el producto utilizando HPLC C18 de fase reversa para separar Tz-PEG7-NH 2 del precursor protegido con Boc. Monitoree Tz-PEG 7-NHBoc y Tz-PEG7-NH 2 a una longitud de onda de 525 nm.
nota: Los tiempos de retención dependen en gran medida de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.), y se deben realizar controles adecuados antes de la purificación. Sin embargo, para presentar un ejemplo, si se utiliza un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0,1% de TFA) a 95:5 MeCN/H2O durante 30 min, un caudal de 1 mL/min y una columna analítica C18 de 4,6 mm x 250 mm, los tiempos de retención de Tz-PEG 7-NHBoc y Tz-PEG7-NH 2 son de alrededor de 18 min y 13 min, respectivamente.
- Congele el eluyente de HPLC recolectado con nitrógeno líquido y envuelva el tubo de recolección ahora congelado en papel de aluminio. Coloque el tubo de recolección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será de un sólido color rosa brillante.
- Reconstituya el producto del paso 3.7, Tz-PEG7-NH 2, con 150 μL de DMSO y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Mida la concentración de Tz-PEG7-NH 2 utilizando un espectrofotómetro UV-Vis que monitorea la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7-NH 2 (ε525) es 535 M-1 cm-1.
>4. La síntesis de Tz-PEG7-DOTA
- Disuelva Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) en 0,15 mL de DMSO (o proceda con la solución creada en el paso 3.8).
- Añada 22 equivalentes molares de TEA (21 μL, 0,15 mmol) a la solución que contiene tetracina del paso 4.1.
- Agregue 10 mg (14,2 μmol) de p-SCN-Bn-DOTA como sólido y agite la solución durante aproximadamente 2 minutos o hasta que el material se disuelva por completo.
- Deje que la reacción se incube durante 30 min a RT con una agitación leve.
- Después de 30 minutos, diluir la reacción 1:1 en H2O y purificar el producto utilizando HPLC de fase reversa C18 para eliminar el p-SCN-Bn-DOTA sin reaccionar. El p-SCN-Bn-DOTA se puede monitorear a una longitud de onda de 254 nm, mientras que el Tz-PEG7-DOTA se monitorea mejor a una longitud de onda de 525 nm.
nota: Obviamente, los tiempos de retención dependen en gran medida de los equipos de HPLC de cada laboratorio (bombas, columnas, tubos, etc.), y se deben realizar controles adecuados antes de la purificación. Sin embargo, para presentar un ejemplo, si se utiliza un gradiente de 5:95 MeCN/H2O (ambos con 0,1% de TFA) a 95:5 MeCN/H2O durante 30 min y una columna analítica C18 de 4,6 x 250 mm, Tz-PEG7-DOTA y p-SCN-Bn-DOTA tienen tiempos de retención de alrededor de 15,6 min y 16,1 min, respectivamente.
- Congele el eluyente de HPLC recolectado con nitrógeno líquido y envuelva el tubo de recolección ahora congelado en papel de aluminio. Coloque el tubo de recolección congelado en un liofilizador durante la noche para eliminar la fase móvil de HPLC. El producto será un polvo de color rosa brillante.
- Reconstituya el producto en 0,15 mL de DMSO y mida la concentración utilizando un espectrofotómetro UV-Vis que controle la longitud de onda de 525 nm. El coeficiente de extinción molar para Tz-PEG7-DOTA (ε525) es 535 M-1 cm-1.
- Analice el compuesto final mediante resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) para verificar que la síntesis fue exitosa. Véase la Tabla 1 para los cambios químicos y los pesos moleculares determinados experimentalmente de todos los compuestos discutidos en este trabajo.
- Guarde la solución purificada de Tz-PEG7-DOTA en la oscuridad a -80 °C.
nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. El precursor completo de Tz-PEG7-DOTA es estable durante al menos 1 año en estas condiciones.
5. 177Lu Radiomarcaje de Tz-PEG 7-DOTA
>PRECAUCIÓN: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, o realizar cualquier otro trabajo con radiactividad, los investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tome todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.
NOTA: Cuando se trabaja con pequeñas cantidades de radiometales, se recomienda que todos los tampones estén libres de trazas de metales para evitar interferencias en la unión del sitio de coordinación.
- En un tubo de centrífuga de 1,7 mL, añadir 200 μL de tampón de acetato de amonio 0,25 M ajustado con alícuotas de 1 M de HCl a pH 5,5.
nota: Si se utilizan menos de 370 MBq de actividad para el etiquetado, el volumen de tampón utilizado debe reducirse a 100 μL.
- Añada la cantidad deseada de [177Lu]LuCl3 a la solución tampón. La cantidad añadida dependerá del número de sujetos en el experimento y de las dosis radiactivas que se administren. Se recomienda añadir 1-2 dosis adicionales de radiactividad como precaución para compensar la posible pérdida de radiactividad durante las etapas de purificación.
- Agregue Tz-PEG7-DOTA en DMSO a la mezcla radiactiva en el Paso 5.2. La cantidad de Tz-PEG7-DOTA depende del número de sujetos que se evalúen. Puede encontrar más detalles sobre este tema en el paso 6.2.2.2.
- Deje que la solución se incube a 37 °C durante 20 minutos.
- Verifique que el radiomarcaje se haya completado mediante cromatografía instantánea por radio en capa fina (radio-iTLC) con 50 mM de EDTA, pH 5,5 como fase móvil. El [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz marcado permanecerá en la línea de base (Rf = 0), mientras que el [177Lu]Lu3+ libre será coordinado por el EDTA y viajará con el frente del solvente, Rf = 1.0 (Figura 1B).
- Si no se logra el marcaje cuantitativo, agregue ligandos para coordinar el radiometal libre. Alternativamente, purifique el [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz etiquetado con un cartucho C18. Siga las instrucciones de uso del fabricante. A continuación se muestra un ejemplo de procedimiento.
- Prepare el cartucho pasando lentamente 5 ml de etanol a través del cartucho con una jeringa grande. Luego, pase 5 mL de acetonitrilo y luego 5 mL de H2O desionizado (DI).
- Extraiga la solución de radioligando del paso 5.3 en una jeringa más pequeña e inyéctela lentamente en el cartucho C18. A continuación, lave el cartucho con 10 mL de DI H2O para eliminar cualquier [177Lu]LuCl3 suelto.
- Eluir con 500 μL de etanol. Retire cualquier etanol del producto final pasando por encima del recipiente con un caudal bajo de nitrógeno seco o argón durante 10-15 min. Posteriormente, vuelva a suspender el radioligando en solución salina en un volumen determinado en el paso 6.2.2.2.
>6. Estudios in vivo
>PRECAUCIÓN: Al igual que en la Sección 5, este paso del protocolo implica el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, los investigadores deben consultar con el Departamento de Seguridad Radiológica de su institución de origen. Tome todas las medidas posibles para minimizar la exposición a la radiación ionizante.
- Preparación de los animales
- En ratones hembra athymic desnudos, implantar subcutáneamente 5 x 106 células de cáncer colorrectal SW1222 suspendidas en 150 μL de una mezcla 1:1 de medios celulares y matriz (por ejemplo, Matrigel) y permitir que crezcan en un xenoinjertode 100-150 mm 3 (14-18 días después de la inoculación).
- Clasificación de animales para un experimento de biodistribución
- Una vez que los tumores tengan el tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibrador, clasifique los animales para asegurarse de que cada cohorte tenga aproximadamente el mismo volumen tumoral promedio. Los animales se pueden distinguir en cada jaula por marcas en la cola con tinta indeleble (una banda, dos bandas, etc.).
- Clasificación de animales para un estudio terapéutico longitudinal
- Una vez que los tumores tengan el tamaño suficiente según lo determinado por la medición del calibrador, coloque marcas en las orejas a cada uno de los animales para garantizar un seguimiento correcto durante todo el experimento.
nota: Las marcas auriculares numéricas pueden caerse a lo largo del experimento. Como resultado, se recomienda acompañar estas marcas físicas con muescas en las orejas de manera sistemática (es decir, derecha, izquierda, bilateral, derecha x 2, izquierda x 2).
- Clasifique los animales de manera que el volumen tumoral promedio de cada cohorte sea aproximadamente igual. El siguiente método para la clasificación de animales se puede realizar utilizando un programa de hoja de cálculo.
- Enumere los números de identificación del animal, el patrón de muesca de la oreja y el volumen del tumor en tres columnas separadas.
- Ordene los datos de menor a mayor volumen tumoral.
- En una cuarta columna, asigne a cada animal un número de jaula y recorra las jaulas en un patrón similar al de una serpiente. Por ejemplo, si hay 5 jaulas, esta columna se llenaría "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." hasta que se asigne una jaula a todos los animales.
- Una vez asignadas las jaulas, ordene los datos por número de jaula. Si se utilizan muescas en las orejas, asegúrese de que cada animal en una jaula determinada tenga un patrón de muescas en las orejas único. Si se duplican (dos o más del mismo patrón) en una jaula determinada, intercambie un ratón por uno de otra jaula con el patrón faltante hasta que cada jaula tenga animales con patrones únicos de muesca en las orejas.
- Formulaciones e inyecciones
nota: La secuencia de inyección tanto para la biodistribución como para el estudio terapéutico procede de la siguiente manera: primero se inyecta huA33-TCO, seguido de [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz después de un intervalo predeterminado.
- Inmunoconjugado
- Diluir una alícuota de la solución huA33-TCO del paso 1.9 a una concentración de 0,8 mg/ml en solución salina estéril al 0,9%.
- Extraiga dosis de 150 μL (100 μg) de solución de huA33-TCO en jeringas pretratadas con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS y almacene estas jeringas en hielo><.
nota: El tratamiento con BSA reduce la unión inespecífica del anticuerpo a las paredes de la jeringa.
- Calentar al animal bajo una lámpara de calor durante 3 minutos para dilatar la vena de la cola.
- Inyecte la solución de huA33-TCO en la vena de la cola del ratón portador de xenoinjertos. Espere 24 horas (o un intervalo de tiempo predeterminado diferente) para que el huA33-TCO se acumule en el tumor del ratón.
- Radioligando
- Radiomarcaje Tz-PEG7-DOTA como se describe en la Sección 5.
- Extraiga dosis de 150 μL de solución salina estéril al 0,9% que contenga equivalentes 1,1 molares de Tz-PEG7-DOTA en relación con la cantidad de huA33-TCO administrada. Por ejemplo, si se inyectaron 100 μg (0,67 nmol) de huA33-TCO en el animal y se hizo la mezcla de reacción [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz con una actividad específica de 12,4 GBq/μmol, se extraerán dosis que contengan 9,14 MBq de actividad cada una. Esto corresponde a 0,74 nmol de Tz (1,1 molar eq. en relación con huA33-TCO).
- Calentar a los animales bajo una lámpara de calor durante 3 minutos para dilatar la vena de la cola.
- Inyecte la dosis de radioligando en la vena de la cola del ratón portador de xenoinjertos. La cantidad de actividad a inyectar es determinada por el investigador. Los datos publicados han mostrado efectos terapéuticos dependientes de la dosis sobre el tamaño del tumor dentro de un rango de 7,4 a 55,5 MBq.
