Extracción de miARN circulante: un método para aislar miARN de muestras de plasma mediante extracción orgánica y enriquecimiento de ARN pequeño

Abstract

Fuente: Canale, M. et al., Detección de un panel personalizado de microARN circulante en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la extracción de microARN circulante de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal utilizando extracción orgánica seguida de enriquecimiento de columna de fibra de vidrio. Los miARN son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, lo que los convierte en biomarcadores circulantes ideales para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico y la toma de decisiones y el seguimiento del tratamiento. Este método ayudará a identificar nuevos biomarcadores circulantes capaces de predecir los resultados clínicos en los pacientes.

Protocol

NOTA: Realice todos los pasos siguientes bajo una campana extractora esterilizada de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).

1. Recolección y almacenamiento de plasma

1. Recoja 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo K3E EDTA.
2. Centrifugar el tubo a temperatura ambiente a 1.880 x g durante 15 min.
3. Recuperar el plasma sobrenadante en alícuotas de 450 μL.
4. Almacene las muestras a -80 °C hasta su uso.
   NOTA: Procese el tubo de sangre periférica dentro de las 2 horas posteriores a la recolección. Al recuperar el plasma del tubo, no altere la capa de linfocitos.

>2. Extracción de miRNAs circulantes de muestras de plasma

1. Prepare todas las soluciones necesarias y descongele las muestras para los pasos de extracción.
   1. Añadir 375 μL de 2-mercaptoetanol a la solución desnaturalizante 2x y mezclar bien.
   2. Agregue 21 mL de etanol 100% de grado ACS a la solución de lavado de miARN I y mezcle bien.
   3. Agregue 40 mL de etanol 100% de grado ACS a la solución de lavado 2/3 y mezcle bien.
   4. Deje que una alícuota de plasma se descongele a temperatura ambiente y luego comience los pasos de extracción.

2. Extracción orgánica
   1. Transfiera 400 μL de la muestra de plasma a un tubo de 2 mL libre de RNasa.
   2. Añadir 400 μL de solución desnaturalizante 2x, mezclar por vórtice y centrifugar brevemente.
   3. Añadir 4 μL de espiga de 1 nM, mezclar por vórtice y centrifugar brevemente.
   4. Añadir 800 μL de fenol-cloroformo ácido.
   5. Vórtice durante 60 s y centrífuga a velocidad máxima (≥10.000 x g) durante 15 minutos.
   6. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. No perturbe la interfase. Anote el volumen recuperado y deseche el tubo que contiene la fase no acuosa.
      nota: La solución desnaturalizante 2x se almacena a 4 °C y puede solidificarse a esta temperatura. Antes de usar, calentar la solución a 37 °C, agitando ocasionalmente durante 10-15 min. Tenga cuidado de retirar la fase inferior que contiene el ácido fenol-cloroformo, no el tampón acuoso que se encuentra encima de la mezcla. Precalentar la solución de elución o el agua sin nucleasas a 95 °C. Tenga cuidado de calentar un volumen adecuado de solución (100 μL por muestra + 10% de exceso).

Enriquecimiento de ARN pequeño
1. Añadir 1/3 de volumen de etanol al 100% a la fase acuosa a partir del paso 2.2.6 y mezclar bien.
2. Coloque un cartucho de filtro en un tubo de recolección nuevo para cada muestra.
3. Transfiera hasta 700 μL de lisado del paso 2.3.1 y etanol al cartucho de filtro y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s.
4. Si quedan >700 μL de mezcla, coloque el filtrado en un tubo nuevo y repita el paso 2.3.3; repita hasta que toda la mezcla haya pasado a través del cartucho filtrante.
5. Mida el volumen total del flujo.
6. Agregue 2/3 de volumen de etanol al 100% para filtrar y mezcle bien.
7. Coloque un segundo cartucho de filtro en un tubo de recolección nuevo.
8. Transfiera hasta 700 μL de volumen de muestra al cartucho y centrifugue a 10.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo.
9. Repita el paso 1.3.8 hasta que toda la mezcla haya pasado a través del cartucho de filtro.
10. Aplique 700 μL de solución de lavado de miRNA 1 al cartucho de filtro y centrifugue el cartucho de filtro con el tubo de recolección a 10.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo. Coloque el cartucho de filtro en el mismo tubo de recolección.
11. Aplique 500 μL de solución de lavado 2/3 al cartucho de filtro y centrifugue el cartucho de filtro con el tubo de recolección a 10.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo. Coloque el cartucho de filtro en un tubo de recolección nuevo.
12. Coloque el cartucho filtrante en un tubo de recolección nuevo y repita el paso 2.3.11 con 500 μL de solución de lavado 2/3. Deseche el flujo y transfiera el cartucho de filtro a un tubo de recolección nuevo.
13. Centrifugar los tubos con los cartuchos de filtro a 10.000 x g durante 1 min.
14. Transfiera el cartucho de filtro a un tubo de recolección nuevo de 1,5 ml y agregue 100 μl de solución de elución precalentada (95 °C) o agua sin nucleasa.
15. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 s para recuperar miRNAs y almacenar a -80 °C.
    nota: Se puede formar un precipitado blanco en la solución de lavado 2/3. Este precipitado es el exceso de EDTA liberado de la solución. Evite extraer estos cristales durante los pasos de pipeteo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos Safe-lock de 1,5 ml sin arnanasa	Eppendorf	0030 123.328
Puntas de 1000 μL sin arnana	Laboratorio estelar	S1122-1830
Tubos Safe-lock de 2 ml sin arnanasa	Eppendorf	0030 123.344
Puntas de 20 μL sin arnanasa	Laboratorio estelar	S1123-1810
Puntas de 200 μL sin arnana	Laboratorio estelar	S1120-8810
Kit de purificación de ARN y proteínas nativas mirVana PARIS	Termo Fisher	AM1556
100% etanol anidro grado ACS	Reactivos Carlo Erba	414605
2-mercapto-etanol	Sigma-Aldrich	M3148
Pipetas de laboratorio de 0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μL
Campana extractora
Microcentrífuga de sobremesa
vórtice