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Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Aislamiento genómico de ADN de heces
NOTA: Utilice un kit comercial para aislar el ADN microbiano de las heces siguiendo un protocolo de detección de patógenos en las heces. Retire las muestras directamente del congelador a -80 °C y guárdelas en hielo seco mientras pesa.
- Transfiera hasta 220 mg de heces a un tubo de microfuga limpio que contenga 1,4 mL de tampón de lisis de heces a temperatura ambiente (RT) (consulte la Tabla de materiales).
- Muestreo de vórtice durante 1 min para homogeneizar completamente los sólidos (Figura 1B). Calentar la suspensión a 95 °C durante 5 min para lisar todas las bacterias (incluidas las bacterias Gram-positivas).
- Muestreo de vórtice durante 15 s y luego centrifugar a 20.000 x g durante 1 min para granular los sólidos de las heces. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga de 2 mL. Agregue un comprimido a cada muestra para absorber los inhibidores de PCR, el vórtice hasta que el comprimido se disuelva e incube la muestra a RT durante 1 min.
- Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 3 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microfuga. Centrifugar a 20.000 x g durante 3 min. Alícuota 15 μL de proteinasa K (20 mg/mL de stock) en un nuevo tubo de microfuga de 1,5 mL. Pipetear 200 μL de la muestra en el tubo que contiene la proteinasa K.
- Añadir 200 μL de tampón de lisis de cloruro de guanidinio al tubo, hacer un vórtice minucioso durante 15 s (ver Tabla de Materiales) e incubar la muestra a 70 °C durante 10 min. Añadir 200 μL de etanol (96-100%) a los tubos y mezclar bien por vórtice.
- Coloque una columna de centrifugación a base de sílice en un tubo de recolección de 2 ml y aplique las muestras a la columna. Cierre la tapa y centrifugue durante 1 minuto a 20.000 x g.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo colector de 2 mL y agregue 500 μL de tampón de lavado 1 a la columna, tape la columna y centrifugue durante 1 min a 20,000 x g. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 2 mL y agregue 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna, Cierre el tapón y centrifugue a 20.000 x g durante 3 min.
- Con la tapa cerrada, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 2 ml y centrifugue durante 1 minuto adicional a 20,000 x g para eliminar el tampón de lavado residual. Transfiera la columna a un tubo de microfuga marcado de 1,5 mL y eluya la muestra agregando 200 μL de tampón de elución que contenga EDTA a la membrana (consulte la Tabla de materiales).
- Cierre el tapón e incube a RT durante 1 min. Centrifugar la muestra durante 1 min a 20.000 x g. Deseche la columna.
>2. Determinación de la concentración de ADN y preparación de muestras para PCR
NOTA: Utilice un fluorómetro y un ensayo fluorescente de dsDNA disponible comercialmente para determinar la concentración de ADN genómico en cada muestra (consulte la Tabla de Materiales). El tinte fluorescente debe unirse específicamente al ADN bicatenario.
- Prepare una dilución 1:200 de cada muestra (1 μL de cada muestra en 199 μL de mezcla maestra de dsDNA) y una dilución 1:50 de los estándares. Analice en un fluorómetro utilizando la configuración de dsDNA.
Nota: Un alto volumen de ADN en la PCR puede ser inhibidor, por lo tanto, el volumen de ADN utilizado no debe ser superior al 10% del volumen final de la PCR. Un fluorómetro permite una medición precisa del ADN en la muestra, ya que solo el ADN unido al tinte fluorescente será fluorescente, eliminando la posible contribución de contaminantes a la concentración final de ADN calculada. Este nivel de cuantificación precisa es esencial para la aplicación de secuenciación posterior.
- Prepare plantillas de PCR diluidas a 5 ng/μL con el volumen adecuado de 10 mM Tris, pH 8,5 para hacer plantillas de trabajo de cada muestra.
- Almacene las muestras a -20 °C.
>3. Diseñe cebadores para las regiones V deseadas 16S
- Diseñe cebadores para amplificar selectivamente las regiones de ARNr V 16S deseadas.
- Analice los cebadores con Probe Match, del Proyecto de Base de Datos Ribosómica, para determinar la tasa de aciertos aproximada para varios filos.
Nota: Para las regiones V1-V3, el estudio actual utilizó los cebadores publicados Bosshard forward, que se une en la posición 8 dentro de la región V1, y 533 reverse, que se une en la posición 533 dentro de la región V3. Los cebadores deben incluir secuencias de adaptador de voladizo para la indexación.
- Al diseñar cebadores, incluya secuencias adaptadoras en los extremos 5' de cada cebador, como se recomienda para la preparación de la biblioteca de secuenciación de metagenómica 16S (Tabla 1).
- Sintetice estos cebadores grandes con purificación por cartucho. Reconstituya los cebadores desecados y diluya un material de trabajo de PCR a 1 μM en 10 mM de Tris, pH 8,5.
>4. Amplicon PCR para amplificar la(s) región(es) V(s) con secuencias de adaptador de voladizo conectadas
- Configure la mezcla de reacción de PCR con amplicón como se describe en la Tabla 2.
- Coloque un sello adhesivo transparente de la placa de PCR en la placa y ejecute la PCR del amplicón utilizando los parámetros de la Tabla 3.
- (Opcional) Ejecute productos de PCR con amplicón en un gel de agarosa o en un ensayo de ADN de alta sensibilidad que permita la medición cuantitativa del tamaño del amplicón (consulte la Tabla de materiales)
Nota: El tamaño del amplicón de este estudio es de 550 pb (Figura 2a).
>5. Limpieza de PCR con perlas magnéticas
- Centrifugar rápidamente la placa de PCR amplicon a 1.000 x g durante 1 min para recoger la condensación.
nota: Se pueden usar tiras de tubos de PCR en lugar de placas de PCR para minimizar la contaminación. Deseche las tapas de los tubos y nunca las reutilice.
- Agite las perlas magnéticas para dispersarlas uniformemente y agregue 20 μL de perlas magnéticas a cada pocillo de PCR amplicónico, luego pipetee todo el volumen hacia arriba y hacia abajo lentamente 10 veces.
- Incubar en RT durante 5 min. Coloque la placa de PCR en un soporte magnético durante 2 min hasta que se recojan las perlas magnéticas y el sobrenadante esté transparente. Retire y deseche el sobrenadante.
- Lave las perlas con 200 μl de etanol fresco al 80% mientras la placa de PCR está en el soporte magnético e incube durante 30 s a RT en el soporte magnético. Retire con cuidado el sobrenadante.
- Repita el lavado por segunda vez. Ahora, use una punta de pipeta fina para eliminar cualquier residuo de etanol de los pocillos y deje que se seque al aire durante 10 minutos.
- Retire la placa de PCR del soporte magnético y añada 52,5 μL de 10 mM Tris pH 8,5 a cada pocillo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para suspender las perlas e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
- Transfiera la placa de PCR al soporte magnético para recoger las perlas magnéticas y transfiera 50 μL del sobrenadante a una placa de PCR limpia. Coloque un sello adhesivo transparente de placa PCR en la placa y almacene a -20 °C durante un máximo de una semana.
| Amplicon Imprimadores de PCR |
| adelante | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| Marcha atrás | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Las secuencias específicas del lugar geométrico se muestran en negrita y las no en negrita son la secuencia del adaptador de voladizo. |
Tabla 1: Cartillas de PCR de Amplicon.
| Configuración de reacción de PCR Amplicon | |
| volumen |
| ADN microbiano (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Cebador delantero (1 μM; del paso 3.1) | 5,0 μl |
| Imprimación inversa (1 μM; del paso 3.1) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Ready Mix | 12,5 μl |
| total | 25,0 μl |
Tabla 2: Cartillas de PCR de Amplicon.
| Configuración de PCR de Amplicon |
| 95 °C durante 3 minutos | |
| 25 Ciclos de: | |
| 95 °C durante 30 segundos |
| 55 °C durante 30 segundos |
| 72 °C durante 60 segundos |
| 72 °C durante 3 minutos | |
| Mantener a 4 °C | |
Tabla 3: Configuración del programa de PCR de Amplicon.
