Marcaje de células organoides del CCR: un método para generar células organoides de cáncer colorrectal transducidas por lentivirus GFP

Resumen

Fuente: Okazawa Y. et al., Detección de alta sensibilidad de micrometástasis generadas por organoides transducidos por lentivirus GFP cultivados a partir de un tumor de colon derivado de un paciente. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe la técnica de generación de organoides de CRC transducidos por partículas lentivirales GFP para permitir la obtención de imágenes fluorescentes. Estos organoides marcados con GFP, cuando se colocan en modelos animales, ayudan a estudiar la invasión tumoral y la metástasis.

Protocolo

1. Generación de organoides CRC cultivados en matriz extracelular artificial

Los procedimientos experimentales para el cultivo de organoides de CCR de las PDX del colon se describen en la Figura 1B (paso 4).

1. Establecer un medio de cultivo adecuado para los organoides de CRC derivados de PDX (véase la Tabla de Materiales, "el medio de cultivo de organoides de CRC") empleando medios previamente descritos para organoides de colon humano.
2. Aplique 150 μL de matriz extracelular artificial (ver Tabla de Materiales) por pocillo en una placa de 12 pocillos sobre hielo y luego incube durante 30-60 min en una incubadora de 37 °C, 5% CO₂ para solidificar los geles.
3. Suspender el pellet celular de células CRC obtenido del modelo de ratón PDX con el medio de cultivo de organoides CRC (del paso 1.1) con FCS al 5% para ajustar a 3 x 10⁵ células/mL. A continuación, siembre 1 mL del medio en la placa artificial recubierta de matriz extracelular preparada en el paso 1.2 e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂. Use un hemocitómetro para contar el número de células tumorales, incluidas las células individuales y los grupos multicelulares (un grupo de células adherentes) en la suspensión celular.
   NOTA: En este estudio, se utiliza FCS al 5% para apagar la actividad enzimática residual de la colagenasa.
4. Recoja cuidadosamente el medio de cultivo, incluidas las células flotantes separadas de la placa artificial recubierta de matriz extracelular, en un tubo de centrífuga de 1,5 ml al día siguiente y centrifugue a 1.400 x g durante 5 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 70 μL de matriz extracelular artificial sobre hielo.
5. Para aumentar la viabilidad de las células de CCR, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre las células organoides tumorales unidas a la placa recubierta de matriz extracelular artificial e incube durante 30 minutos en una incubadora de 37 °C con 5% de CO₂ para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial. A continuación, incubar con 1 mL del medio de cultivo de células organoides CRC con FCS al 1% a 37 °C bajo 5% de CO₂.
6. Cambie el medio de cultivo cada dos días. A medida que los organoides del CRC llenan el medio, puede ser necesario cambiar el medio diariamente.

>2. Generación y enriquecimiento de partículas lentivirales GFP

Los procedimientos experimentales para la generación y enriquecimiento de partículas lentivirales GFP se describen en la Figura 1C (paso 5).

1. Cultive HEK293T células con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de FCS y prepare seis placas de 10 cm (2 x 10⁶ células por placa) para el siguiente procedimiento de transfección.
2. Para la transfección por placa, prepare 500 μL de la mezcla, incluidos 20 μL del reactivo de transfección en DMEM con un vector PRRL-GFP (5 μg) y dos plásmidos de empaquetamiento lentiviral, como pCMV-VSV-G (1 μg) y pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), en un microtubo estéril de 1,5 mL. Mantenga la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min y luego colóquela en cada uno de los platos de 10 cm e incube durante 18 h.
3. Retirar el medio, añadir 5 mL de medio fresco FCS-RPMI 1640 al 10% a cada plato, y dejar reposar durante 24 h.
4. Recoja el medio acondicionado de cada placa en un tubo de centrífuga de 50 ml y almacene un total de 30 ml del medio a 4 °C durante la noche. Añadir 5 mL del RPMI 1640 fresco en cada plato y dejar reposar durante 24 h.
5. Recoja el medio acondicionado de cada plato en un tubo de centrífuga de 50 mL y mantenga, en total, 30 mL del medio en hielo. A continuación, desecha las células.
6. Filtrar 60 mL del medio (a partir de los pasos 2.4-2.5) a través de un filtro de 0,45 μm para eliminar las células y dividir esta cantidad en doce tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL para ultracentrifugación.
7. Para concentrar los virus, centrifugarlos con un rotor de cangilón oscilante a 85.327 x g durante 1,5 h a 4 °C.
8. Retire inmediatamente el medio. Para resolver el pellet de virus concentrado, coloque 250 μL de Nutrient Ham Mix F-12 (F12)/DMEM medium sin FCS en cada uno de los doce tubos y manténgalo a 4 °C durante la noche. Tenga en cuenta que la bolita del virus suele ser invisible.
9. Pipetear suavemente el medio para recoger 3 mL de la reserva concentrada de lentivirus GFP 5x, en total, presumiblemente incluyendo partículas lentivirales GFP con 10⁸ unidades de transducción por mL (TU/mL). A continuación, almacene los doce microtubos de 1,5 ml (incluidos 250 μl por tubo) en condiciones estériles a -80 °C durante un año. Prepare muchas alícuotas pequeñas de la solución original para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación.

>3. Marcaje de células organoides de CCR con partículas lentivirales GFP cultivadas en matriz extracelular artificial

Los procedimientos experimentales para marcar las células organoides del CCR con lentivirus GFP se describen en la Figura 1C (paso 6).

1. Deje que los organoides CRC preparados en el paso 1.6 crezcan sin interferencias durante 7-10 días, recoseche mecánicamente con un raspador de células estériles y transfiéralos a un microtubo de 1.5 mL.
   nota: El crecimiento de los organoides del CCR en cultivo depende de la naturaleza de los tumores originales de los pacientes. Evite el crecimiento excesivo de los organoides del CCR manteniéndolos en una confluencia del 60-70% antes de la transferencia en una proporción de división de 1:2 a una nueva placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial.
2. Centrifugar el microtubo durante 3 minutos a 1.400 x g, retirar el medio de cultivo y resolver el pellet de células en 500 μL de PBS mediante un golpeteo suave.
3. Centrifugar el microtubo durante 3 min a 1.400 x g y eliminar el PBS.
4. Para disociar los organoides de CRC adherentes, agregue 500 μL de una solución de desprendimiento celular de enzimas proteolíticas y colagenolíticas al pellet celular en el tubo y mézclelo mediante golpecitos suaves. Luego, deje que los tubos se asienten durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Pipetear muy suavemente la suspensión celular con 500 μL adicionales de FCS-DMEM al 1% varias veces en un microtubo de 1,5 mL para disociar aproximadamente las células. La generación de células individuales a partir de los organoides del CRC mediante pipeteo intensivo reduce notablemente la viabilidad celular. Por lo tanto, es esencial dejar la masa de células visualmente detectable en la suspensión celular mediante un pipeteo suave en un microtubo de 1,5 mL.
6. Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 1.400 x g y retirar el sobrenadante.
7. Resuelva el pellet celular con una mezcla de 100 μL de stock de lentivirus 5x GFP (>10⁸ TU/mL) y 400 μL del medio de cultivo de organoides CRC en un microtubo de 1,5 mL mediante golpecitos suaves para ajustar a una concentración de 5 x 10^{5 células} tumorales disociadas por 500 μL. Utilice un hemocitómetro para contar el número de células tumorales. incluyendo células individuales y grupos de células en la suspensión celular, como se ha descrito anteriormente (paso 1.3).
8. Prepare una placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se describe en el paso 1.2. A continuación, coloque 500 μL de la suspensión celular preparada en el paso 3.7 en la placa y déjela actuar durante 18 h a 37 °C por debajo del 5% de CO₂.
9. Recoja el medio con las células flotantes separadas de la placa recubierta de matriz extracelular artificial en un tubo de centrifugación de 1,5 mL. Centrifugar a 1.400 x g y luego retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 70 μL de matriz extracelular artificial sobre hielo.
10. Para aumentar la viabilidad de las células de CCR, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre los organoides tumorales unidos a la placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se describe en el paso 1.5. A continuación, incubar la placa durante 30 min en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial y luego cultivarla con 1 mL del medio de cultivo de organoides CRC con FCS al 1% a 37 °C bajo 5% de CO₂.
11. Observe las células tres días después de la infección bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar una positividad de GFP de casi el 100% debido al uso de un título alto de partículas lentivirales (ver Figura 2A).
12. Cultive los organoides del CRC durante 7-10 días para expandir el crecimiento celular antes de inyectarlos en los ratones receptores.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática de la generación de metástasis por los organoides de CCR derivados de PDX marcados con lentivirus GFP en ratones NOG.(A) Implantación de pequeñas piezas de tejido del CCR por vía subcutánea en ratones NOG (paso 1). El tejido del CCR diseccionado quirúrgicamente del paciente se cortó en pedazos y se implantó por vía subcutánea en ratone...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 12 pocillos	BMBio	#92412
microtubo	Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes de usar
Hemotómetro	Erma	#03-202-1
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	#354234	Almacene las alícuotas a -20 ° C. Coloque en hielo hasta su uso
Colagenasa tipo 1	sigma	#C1030	150 mg/ml colagenasa tipo1 en 1×PBS. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 año
DMEM/F-12 con GlutaMAX™	Gibco	#10565018
penicilina	Gibco	#15140122	Conservar a 4 °C. Utilizar en 1 mes
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Almacenar a -20 °C. Agregar al medio el mismo día de uso
Y27632, un inhibidor de ROCK	Wako	#253-00591	Almacenar a -20 °C. Agregar al medio el mismo día de uso
estreptomicina	Gibco	#15140122	Conservar a 4 °C. Utilizar en 1 mes
Medio de cultivo de organoides CRC con 1% o 5% de FCS			DMEM/F-12 con suplemento de GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado con FCS al 1% o al 5%, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF y 10 μM Y27632, un inhibidor de ROCK. Conservar a 4°C. Utilizar en el plazo de 1 mes.
Vector PRRL-GFP	Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
el regente de transfección FuGENE 6	Roche	11814 443001
pCMV-VSV-G	Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Regalo del Dr. Robert A. Weinberg
un microscopio de estereofluorescencia Zeiss Axioplan 2	Zeiss