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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Disección de PDX de CRC de ratones
Los procedimientos experimentales para la disección de PDX del CCR se describen en la Figura 1B (paso 2).
- Permita que el tumor crezca subcutáneamente hasta ~ 1 cm3 de tamaño, lo que generalmente toma aproximadamente 1-3 meses.
- Anestesiar al ratón con inhalación de isoflurano utilizando el dispositivo de anestesia inhalación de animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%.
- Coloque el ratón en posición prona sobre la mesa del laboratorio. Incidir la piel, exponer el tumor y separar cuidadosamente la piel del tumor con unas tijeras estériles. Después de extirpar el tumor, colóquelo en una placa de Petri de 10 cm, retire las regiones necróticas macroscópicas del tumor y luego enjuague dos veces con 5 mL de PBS.
nota: Las áreas necróticas suelen ser más blancas, blandas y friables que las áreas circundantes.
- Coloque el tumor en hielo y divídalo en partes iguales en al menos 4 partes para diferentes aplicaciones, que incluyen 1) el cultivo de organoides de CCR, 2) el trasplante en ratones secundarios, 3) el examen histológico y 4) la congelación y el almacenamiento de los fragmentos tumorales.
- Para la generación de los organoides del CCR, se coloque el tejido tumoral sólido en una placa de Petri de 6 cm que contenga 1 mL de PBS estéril. Mantenga el pañuelo en hielo hasta el procesamiento.
- Para establecer el modelo PDX para el CRC humano, pase los PDX CRC nuevos a un mouse secundario. Cortar el tejido tumoral en trozos pequeños (5 x 5 x 5 mm3 de tamaño) con cuchillas de afeitar estériles y sumergir suavemente estos fragmentos de tejido en 50 μL de matriz extracelular artificial. A continuación, implanta estos fragmentos en las partes inferiores de las bolsas subcutáneas derecha e izquierda del ratón NOG.
- Coloque el ratón anestesiado en posición prona en la mesa del laboratorio. Realizar una pequeña incisión en las partes inferiores de los flancos derecho e izquierdo del ratón receptor para generar bolsas subcutáneas para la implantación de tejido mediante tijeras estériles. Tenga cuidado de no perforar la membrana peritoneal. Debería haber poco sangrado con este procedimiento.
- Sumerja suavemente los fragmentos tumorales preparados anteriormente en 50 μL de matriz extracelular artificial y luego implante en las partes inferiores de las bolsas subcutáneas derecha e izquierda.
- Suturar la incisión con clips para heridas en los ratones sometidos a procedimientos quirúrgicos. Asegúrese de que los tejidos tumorales implantados estén ubicados a cierta distancia de la incisión debajo de la piel><.
nota: De acuerdo con la minimización de los procedimientos quirúrgicos, en este estudio no se administraron tratamientos para el dolor postquirúrgico y la infección.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla tibia y mantenga la posición reclinada esternal hasta que se restablezca la conciencia suficiente. Una vez que estén completamente recuperados y puedan sentarse sobre las cuatro patas, los ratones pueden ser devueltos a sus jaulas de origen. Para evitar la depredación, no permita la cría con animales no operados en la misma jaula.
- Para el análisis histológico, fije las muestras en 5 mL de formalina tamponada neutra al 10% en un tubo cónico de 15 mL a temperatura ambiente durante 2 días.
- Para la criopreservación, corte el tejido tumoral en trozos pequeños (5 x 5 x 5 mm3 de tamaño) y sumerja suavemente las muestras en 500 μL de solución de congelación celular en tubos crioviales de 1-1,5 mL. A continuación, transfiera el tubo a un congelador a -80 °C.
>2. Extracción de PDXs en la suspensión celular para el cultivo de organoides CRC
Los procedimientos experimentales para la disociación de las PDX del CCR se describen en la Figura 1B (paso 3).
- Coloque los fragmentos tumorales preparados anteriormente (paso 1.4.1) en una placa de Petri de 10 cm.
- Picar los fragmentos con hojas de afeitar estériles y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL que contenga 8 mL de suero de ternera fetal al 10% (FCS)-Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) con 80 μL de caldo de enzimas colagenasa (ver Tabla de Materiales).
- Cierre el tubo herméticamente y envuelva la tapa con parafilm para evitar fugas. Para disociar los fragmentos tumorales picados en la suspensión celular, agite suavemente durante 2 h a 37 °C. Tenga en cuenta que todavía quedarán muchos fragmentos de tejido sin digerir en el tubo.
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Resuelva el pellet de celda usando 10 mL de FCS-DMEM al 10% para hacer la suspensión de celdas.
- Para eliminar los restos de tejido no digeridos, filtre la suspensión celular dos veces con el filtro celular de 40 μm colocado en un tubo cónico de 50 mL. A continuación, centrifugar el flujo a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y mantenga el pellet en hielo.
>3. Generación de organoides de CRC cultivados en matriz extracelular artificial
Los procedimientos experimentales para el cultivo de organoides de CCR de las PDX del colon se describen en la Figura 1B (paso 4).
- Establecer un medio de cultivo adecuado para los organoides de CRC derivados de PDX (véase la Tabla de Materiales, "el medio de cultivo de organoides de CRC") empleando medios previamente descritos para organoides de colon humano.
- Aplique 150 μL de matriz extracelular artificial (ver Tabla de Materiales) por pocillo en una placa de 12 pocillos sobre hielo y luego incube durante 30-60 min en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 para solidificar los geles.
- Suspenda el pellet celular del paso 2.5 con el medio de cultivo de organoides CRC (del paso 3.1) con FCS al 5% para lograr el ajuste a 3 x 105 células/mL. A continuación, siembre 1 mL del medio en la placa artificial recubierta de matriz extracelular preparada en el paso 3.2. e incubar durante la noche a 37 °C bajo 5% de CO2. Use un hemocitómetro para contar el número de células tumorales, incluidas las células individuales y los grupos multicelulares (un grupo de células adherentes) en la suspensión celular.
NOTA: En este estudio, se utiliza FCS al 5% para apagar la actividad enzimática residual de la colagenasa.
- Recoja cuidadosamente el medio de cultivo, incluidas las células flotantes separadas de la placa artificial recubierta de matriz extracelular, en un tubo de centrífuga de 1,5 ml al día siguiente y centrifugue a 1.400 x g durante 5 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 70 μl de matriz extracelular artificial sobre hielo.
- Para aumentar la viabilidad de las células de CCR, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre las células organoides tumorales unidas a la placa recubierta de matriz extracelular artificial e incube durante 30 minutos en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial. A continuación, incubar con 1 mL del medio de cultivo de células organoides CRC con FCS al 1% a 37 °C bajo 5% de CO2.
- Cambie el medio de cultivo cada dos días. A medida que los organoides del CRC llenan el medio, puede ser necesario cambiar el medio diariamente.
>4. Generación y enriquecimiento de partículas lentivirales GFP
Los procedimientos experimentales para la generación y enriquecimiento de partículas lentivirales GFP se describen en la Figura 1C (paso 5).
- Cultive HEK293T células con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de FCS y prepare seis placas de 10 cm (2 x 106 células por placa) para el siguiente procedimiento de transfección.
- Para la transfección por placa, prepare 500 μL de la mezcla, incluidos 20 μl del reactivo de transfección en DMEM con un vector PRRL-GFP (5 μg)12 y dos plásmidos de empaquetamiento lentiviral, como pCMV-VSV-G (1 μg) y pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), en un microtubo estéril de 1,5 mL. Mantenga la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min y luego colóquela en cada uno de los platos de 10 cm e incube durante 18 h.
- Retirar el medio, añadir 5 mL de medio fresco FCS-RPMI 1640 al 10% a cada plato, y dejar reposar durante 24 h.
- Recoja el medio acondicionado de cada placa en un tubo de centrífuga de 50 ml y almacene un total de 30 ml del medio a 4 °C durante la noche. Añadir 5 ml del RPMI 1640 fresco en cada plato y dejar reposar durante 24 h.
- Recoja el medio acondicionado de cada plato en un tubo de centrífuga de 50 mL y mantenga, en total, 30 mL del medio en hielo. A continuación, desecha las células.
- Filtrar 60 mL del medio (a partir de los pasos 4.4-4.5) a través de un filtro de 0,45 μm para eliminar las células y dividir esta cantidad en doce tubos de centrífuga de polipropileno de 5 mL para la ultracentrifugación.
- Para concentrar los virus, centrifugarlos utilizando un rotor de cangilón oscilante (véase la tabla de materiales) a 85.327 x g durante 1,5 h a 4 °C.
- Retire inmediatamente el medio. Para resolver el pellet de virus concentrado, coloque 250 μL de Nutrient Ham Mix F-12 (F12)/DMEM medium sin FCS en cada uno de los doce tubos y manténgalo a 4 °C durante la noche. Tenga en cuenta que la bolita del virus suele ser invisible.
- Pipetear suavemente el medio para recoger 3 mL de la reserva concentrada de lentivirus GFP 5x, en total, presumiblemente incluyendo partículas lentivirales GFP con 108 unidades de transducción por mL (TU/mL). A continuación, almacene los doce microtubos de 1,5 ml (incluidos 250 μl por tubo) en condiciones estériles a -80 °C durante un año. Prepare muchas alícuotas pequeñas de la solución original para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación.
>5. Marcaje de células organoides de CRC con partículas lentivirales GFP cultivadas en matriz extracelular artificial
Los procedimientos experimentales para marcar las células organoides del CCR con lentivirus GFP se describen en la Figura 1C (paso 6).
- Deje que los organoides del CRC preparados en el paso 3.6 crezcan sin interferencias durante 7-10 días, recoséchelos mecánicamente con un raspador de células estériles y luego transfiéralos a un microtubo de 1.5 mL.
nota: El crecimiento de los organoides del CCR en cultivo depende de la naturaleza de los tumores originales de los pacientes. Evite el crecimiento excesivo de los organoides del CCR manteniéndolos en una confluencia del 60-70% antes de la transferencia en una proporción de división de 1:2 a una nueva placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial.
- Centrifugar el microtubo durante 3 minutos a 1.400 x g, retirar el medio de cultivo y resolver el pellet de células en 500 μL de PBS mediante un golpeteo suave.
- Centrifugar el microtubo durante 3 min a 1.400 x g y eliminar el PBS.
- Para disociar los organoides de CRC adherentes, agregue 500 μL de una solución de desprendimiento celular de enzimas proteolíticas y colagenolíticas al pellet celular en el tubo y mézclelo mediante golpecitos suaves. Luego, deje que los tubos se asienten durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Pipetear muy suavemente la suspensión celular con 500 μL adicionales de FCS-DMEM al 1% varias veces en un microtubo de 1,5 mL para disociar aproximadamente las células. La generación de células individuales a partir de los organoides del CRC mediante pipeteo intensivo reduce notablemente la viabilidad celular. Por lo tanto, es esencial dejar la masa de células visualmente detectable en la suspensión celular mediante un pipeteo suave en un microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 1.400 x g y retirar el sobrenadante.
- Resuelva el pellet celular con una mezcla de 100 μl de stock de lentivirus 5x GFP (>108 TU/mL) y 400 μl del medio de cultivo de organoides CRC en un microtubo de 1,5 mL mediante golpecitos suaves para ajustar a una concentración de 5 x 105 células tumorales disociadas por 500 μl. Utilice un hemocitómetro para contar el número de células tumorales. incluyendo células individuales y grupos de células en la suspensión celular, como se ha descrito anteriormente (paso 3.3).
- Prepare una placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se describe en el paso 3.2. A continuación, coloque 500 μl de la suspensión celular preparada en el paso 5.7 en la placa y déjela actuar durante 18 h a 37 °C con un 5% de CO2.
- Recoja el medio con las células flotantes separadas de la placa recubierta de matriz extracelular artificial en un tubo de centrifugación de 1,5 mL. Centrifugar a 1.400 x g y luego retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 70 μl de matriz extracelular artificial sobre hielo.
- Para aumentar la viabilidad de las células de CCR, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre los organoides tumorales unidos a la placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se describe en el paso 3.5. A continuación, incubar la placa durante 30 min en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para solidificar el recubrimiento de la matriz extracelular artificial y luego cultivarla con 1 mL del medio de cultivo de organoides CRC con FCS al 1% a 37 °C bajo 5% de CO2.
- Observe las células a los 3 días después de la infección bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar una positividad de GFP de casi el 100% debido al uso de un título alto de partículas lentivirales (ver Figura 2A).
- Cultivar los organoides del CCR durante 7-10 días para expandir el crecimiento celular antes de inyectarlos en los ratones receptores.
>6. Generación de metástasis por organoides de CCR marcados con GFP en ratones receptores
Los procedimientos experimentales para la generación de metástasis utilizando los organoides de CCR marcados con GFP se describen en la Figura 1C (paso 7).
- Para disociar los organoides de CCR marcados con GFP en la suspensión celular, recoséchelos mecánicamente con un raspador de células estéril y transfiéralos a un microtubo de 1,5 mL, como se describe anteriormente (paso 5.1).
- Centrifugar el microtubo durante 3 minutos a 1.400 x g, retirar el medio de cultivo y resolver el pellet celular en 500 μL de PBS mediante un golpeteo suave.
- Centrifugar el microtubo durante 3 min a 1.400 x g y eliminar el PBS.
- Superponga 500 μL de la solución de desprendimiento de células sobre el pellet de células en el tubo y mézclelo mediante un golpecito suave. A continuación, deje reposar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para disociar enzimáticamente los organoides de CRC adherentes, como se ha descrito anteriormente (paso 5.4).
- Pipetear muy suavemente la suspensión celular con 500 μL adicionales de FCS-DMEM al 1% varias veces en un microtubo de 1,5 mL para disociar aproximadamente las células, como se describe anteriormente (paso 5.5). La generación de células individuales a partir de los organoides del CRC mediante pipeteo intensivo reduce notablemente la viabilidad celular. Por lo tanto, deje la masa de células visualmente detectable en la suspensión celular pipeteando suavemente en un microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 1.400 x g y retirar el sobrenadante.
- Para establecer un modelo murino de metástasis espontánea de PDX de CCR:
- Prepare una suspensión celular que incluya 5 x 105 células en 50 μL de PBS con un 50% de matriz extracelular artificial por ratón. Mantenga la suspensión en hielo antes de usar. Utilice un hemocitómetro para contar las células cancerosas, como se indica en el paso 3.3.
- Anestesiar a un ratón con inhalación de isoflurano utilizando el dispositivo de anestesia inhalatoria para animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%. Asegurar la frecuencia y profundidad normales de la respiración y la ausencia de un reflejo de pinzamiento de los dedos del pie para una anestesia adecuada. El ungüento veterinario en los ojos es una opción para prevenir la sequedad ocular mientras se está bajo anestesia.
- Coloque el ratón NOG en posición supina en la mesa del laboratorio. Agarre la mucosa rectal con pinzas estériles y sáquela suavemente del ano. A continuación, inyecte inmediatamente la suspensión celular preparada en el paso 6.7.1 en la submucosa rectal del ratón con una jeringa (tamaño de la aguja: 22 G). Rutinariamente, se utilizan de 4 a 6 ratones por grupo para evaluar los resultados.
