Establecimiento de un modelo experimental de metástasis en ratones: implantación de células organoides que expresan GFP en el modelo PDX para detectar micrometástasis

Resumen

Fuente: Okazawa, Y. et al. Detección de alta sensibilidad de micrometástasis generadas por organoides transductidos con lentivirus GFP cultivados a partir de un tumor de colon derivado de un paciente. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe el protocolo para generar metástasis por los organoides de CCR derivados de PDX marcados con lentivirus GFP en el bazo de un ratón inmunodeficiente. Las micrometástasis cancerosas que colonizan otros órganos se pueden detectar utilizando un microscopio de fluorescencia para evaluar la expresión de GFP.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Generación de metástasis por organoides de CCR marcados con GFP en ratones receptores

1. Para establecer un modelo experimental de metástasis de PDX del CCR:
   1. Prepare una suspensión de células organoides CRC que incluya 4 x 10⁴ células en 50 μL de PBS por ratón. Mantenga la suspensión en hielo antes de usar. Use un hemocitómetro para contar las células cancerosas. (Cuente el número de células tumorales, incluidas las células individuales y los grupos multicelulares en la suspensión celular).
   2. Anestesiar a un ratón con inhalación de isoflurano utilizando el dispositivo de anestesia inhalatoria para animales pequeños y desinfectar la piel con etanol al 70%. Asegurar la frecuencia y profundidad normales de la respiración y la ausencia de un reflejo de pinzamiento de los dedos del pie para una anestesia adecuada. El ungüento veterinario en los ojos es una opción para prevenir la sequedad ocular mientras se está bajo anestesia.
   3. Coloque el ratón NOG anestesiado en posición prona en la mesa del laboratorio. Realice una pequeña incisión en la parte inferior del flanco izquierdo y luego corte el peritoneo para exponer cuidadosamente el bazo con tijeras y pinzas estériles. Agarre el tejido graso adherido al bazo con pinzas estériles, luego inyecte lentamente 50 μL de la suspensión celular (preparada como se indicó anteriormente, paso 1.1) en el bazo. Asegúrese de que la suspensión celular se inyecte adecuadamente sin fugas hacia el exterior, desde el bazo. Rutinariamente, se utilizan 4 ratones por grupo para evaluar los resultados.
2. Coloque a todos los ratones en una almohadilla tibia después de la cirugía y manténgalos en una posición reclinada esternal hasta que se restablezca la conciencia suficiente. Una vez que los ratones se hayan recuperado por completo y sean capaces de sentarse sobre las cuatro patas, devuélvalos a sus jaulas de origen. Para evitar la depredación, no permita la cría con animales no operados en la misma jaula.
3. Compruebe si hay fugas de sutura y confirme que los ratones están vivos, en el grupo tratado quirúrgicamente, al día siguiente. Revise los ratones en busca de signos de enfermedad y mida el tamaño de los tumores, empleando calibradores, en todos los ratones una vez a la semana.
4. Observar ratones para detectar metástasis espontáneas (durante períodos de hasta 2,5 meses) y metástasis experimentales (1 mes) después de la inyección.
5. Sacrificar los ratones mediante anestesia y luxación cervical en los días indicados. Diseccionar tumores primarios y varios tejidos, como el hígado y los pulmones. Coloque los tumores y órganos disecados en 5 ml de PBS helado en una placa de Petri de 10 cm y guárdelos en hielo.
6. Para detectar células organoides de CCR positivas para GFP, observe los tejidos disecados con un microscopio de fluorescencia estereoscópica. Adquiera imágenes con una cámara CCD y prepárelas utilizando un software de procesamiento de imágenes estándar

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones NOD/Shi-scid IL2Rγ nulos (NOG)	Instituto Central de Animales de Experimentación, Kanagawa, Japón	Cría ratones machos de 6 semanas de edad en condiciones libres de gérmenes y patógenos específicos
Pinzas para heridas 2×10mm	Fabricación de Natsume, Japón	#C-21-S	Autoclave antes de usar
Tamaño de la aguja de la jeringa Hamilton: calibre 22	Ciencia de Tokio, Japón	Desinfectar con alcohol al 70% y PBS estéril.
Tubo cónico de 50 ml	Baquelita Sumitomo	MS-57500
microtubo	Eppendorf	#0030120086	Autoclave antes de usar
Hemotómetro	Erma	#03-202-1
Medio de cultivo de organoides CRC con 1% o 5% de FCS			DMEM/F-12 con suplemento de GlutaMAX™ (Gibco #10565018) suplementado con FCS al 1% o al 5%, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 ng/ml de hEGF y 10 μM Y27632, un inhibidor de ROCK. Conservar a 4°C. Utilizar en el plazo de 1 mes.
un microscopio de fluorescencia estereoscópica Zeiss Axioplan 2	Zeiss