Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inducción de tumores locales a través de la infección quirúrgica por adeno-cre
- Preparación de animales para cirugía
nota: Prácticamente cualquier mutación condicional puede ser inducida a través del método aquí descrito. Se recomienda el uso de mutaciones en genes relevantes para el cáncer colorrectal, como Apc, Kras o Tp53. La eficiencia de la recombinación de Cre depende del tamaño del constructo a extirpar. Las secuencias floxadas grandes se extirpan de manera menos eficiente. La recombinación de todos los alelos debe confirmarse en los tumores mediante PCR.
- Para el desarrollo de tumores colorrectales, utilice una cruz de los siguientes alelos condicionales para un modelo básico de CCR (número de base de datos MGI entre paréntesis):
Apctm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Si se requiere un alelo indicador de fluorescencia (por ejemplo, para detectar micrometástasis), utilice el siguiente alelo:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
nota: Todas las cepas anteriores están disponibles a través del Repositorio de Ratones del NCI o del Laboratorio Jackson. No se requiere ayuno, ya que toda la materia fecal restante se puede eliminar antes de la infección adenoviral. El ayuno preoperatorio conduce a una mayor mortalidad perioperatoria y constituye un tremendo estrés para los pequeños roedores.
- Use sevoflurano a 3 - 3.5 vol% para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea.
- Cubrir los ojos del ratón anestesiado con ungüento oftálmico para evitar la desecación de la córnea.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una mesa pequeña. Utilice cintas adhesivas no traumáticas para sujetar el ratón.
- Afeitar el abdomen con una afeitadora eléctrica (se puede utilizar alternativamente crema depilatoria) y desinfectar con hisopos con alcohol o yodo. Utilice el tiempo de contacto recomendado por el fabricante.
- Cubra el campo quirúrgico con paños estériles.
nota: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las directrices institucionales.
- Utilice instrumentos estériles, de un solo uso o esterilizados para todos los procedimientos quirúrgicos.
- Laparotomía de la línea media y exposición del colon
- Use tijeras (se pueden usar bisturíes alternativamente) para hacer una incisión en la línea media (~ 15 mm) en la piel de la parte inferior del abdomen.
- Recoge la musculatura de la pared abdominal con pinzas y haz una incisión cuidadosa con unas tijeras, abriendo la cavidad abdominal.
- Identificar el colon distal, solo tocarlo con pinzas atraumáticas. Pinzar el colon con una pinza delicada (p. ej., una pinza vascular Micro Serrefine) a unos 15 mm proximalmente del ano.
nota: Preste especial atención a la vulnerabilidad del colon en todo momento. La perforación conduce inevitablemente a peritonitis y sepsis y requiere la eutanasia del animal.
- Infección segmentaria del colon por el virus Adeno-cre
- Inserte un tubo flexible de teflón por vía transanal y avancelo con cuidado hasta que alcance la oclusión de lúmen lograda por la pinza previamente colocada a 15 mm del borde anal. No utilice una fuerza excesiva, ya que esto puede provocar perforaciones.
- Cánula el tubo con una cánula de 30 G, conecte una jeringa estándar de 1 ml y enjuague el colon con solución salina normal para evacuar la materia fecal restante. Esto puede requerir varios ml de solución salina.
- Una vez que el colon distal esté vacío, retire el tubo y reemplácelo con un tubo de teflón nuevo y vuelva a colocarlo directamente distal a la pinza como se describió anteriormente.
- Ocluir el colon con una segunda pinza ~ 3 mm distal a la pinza proximal (es decir, sobre el tubo insertado, a ~ 12 mm del borde anal), lo que resulta en un segmento aislado de 3 mm a infectar.
nota: Para la oclusión distal del segmento, las pinzas para arterias coronarias Fogarty han demostrado ser las más adecuadas, ya que están recubiertas de goma, lo que provoca una oclusión ajustada del colon a pesar del tubo intraluminal entre las ramas de la pinza.
- Utilice una segunda jeringa (estándar de 1 ml con una cánula de 30 g) para inyectar cuidadosamente 50 - 80 μL de tripsina-EDTA al 0,25% en el segmento de colon pinzado e incubar durante 10 minutos. Deje la cánula y la jeringa conectadas al tubo de teflón para evitar que el líquido se escape><.
nota: El colon debe estar inflado para romper la barrera mucosa y llegar a las células madre de la cripta, pero no demasiado inflado para evitar la perforación del segmento pinzado.
- Primero, retire la pinza distal y luego el tubo de tripsina.
- Enjuague el colon distal con ~ 500 μL de solución salina normal para eliminar la tripsina restante.
- Inserte un nuevo tubo de teflón, vuelva a colocar la pinza distal en su lugar e infle el segmento de colon con 50 a 80 μL de solución adenoviral (1011 unidades formadoras de placa [PFU)/mL en solución salina tamponada con fosfato") e incube durante 30 min (Figura 2A).
nota: No derrame la solución viral, ya que el contacto con adeno-cre puede provocar el desarrollo de tumores en cualquier tejido de ratones condicionalmente mutantes.
- Retire las abrazaderas y el tubo.
- Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
- Cierre la pared abdominal con suturas de rápida absorción 6-0 (p. ej., polidioxanona (PDS)).
- Cierre la piel con pinzas para heridas quirúrgicas.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 38 °C hasta que se recupere por completo de la anestesia.
- Administrar otro bolo de 0,05 mg/kg de buprenorfina i.p. 12 h después de la cirugía, seguido de bolos adicionales de buprenorfina cada 12 h si es necesario.
- Monitoree a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento tumoral.
2. Colonoscopia
NOTA: Dependiendo de las mutaciones condicionales utilizadas, la infección adenoviral conduce a tumores endoscópicamente visibles en un plazo de 2 a 4 semanas. Por lo tanto, realice la primera colonoscopia postoperatoria 2 semanas después de la inducción adenoviral y repita cada 2 semanas. Se recomienda un sistema disponible en el mercado para la colonoscopia murina.
- Preparación de animales para colonoscopia
nota: No se requiere ayuno. La materia fecal restante suele estar bien formada en el colon distal y puede ser empujada más allá del tumor durante la colonoscopia, lo que hace innecesario el estresante proceso de ayuno repetido.
- Use sevoflurano a 3 - 3.5 vol% para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con ungüento oftálmico para evitar la desecación de la córnea.
- Sujete a los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña.
- colonoscopia
- Inserte el endoscopio (diámetro 1,9 mm; longitud 10 cm) en el tracto intestinal a través del ano e inhale aire cuidadosamente bajo control visual para distender el colon. No inhale más aire del requerido para el examen.
nota: Para la insuflación de aire, se puede utilizar la bomba de aire antivaho del sistema de colonoscopia. Si no se dispone de una bomba de aire antivaho, se puede utilizar cualquier otra bomba de aire con ajustes de muy baja presión o aire presurizado con una delicada válvula reductora de presión. El dióxido de carbono (CO2) conduce fácilmente a la acidosis en pequeños roedores y, por lo tanto, debe evitarse.
- Empuje cuidadosamente el endoscopio hacia adelante hasta que se pueda identificar una lesión mucosa en el colon distal (Figura 1A - 1D).
- Guarde las imágenes endoscópicas para su posterior evaluación. Ya se ha descrito un sistema de puntuación endoscópica para tumores intraluminales.
- Retire con cuidado el visor y coloque el ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 38 °C hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
