1. Ensayo de unión a microtúbulos
- Para el ensayo de unión a microtúbulos, agregue ~ 1 x 106 6 células HCT 116 en placas de cultivo de tejidos de 100 mm que contengan los medios esenciales mínimos (MEM) suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Después de un día de cultivo, las células alcanzarán un 60-70% de confluencia.
- Prepare 1X (2 mL) de tampón PEM a partir de 10X tampón PEM almacenado a 4 °C añadiendo 20 μM (40 μL) de paclitaxel y 1 mM (20 μL) de GTP. Tome el material de microtúbulos (TM) del congelador de -80 °C y el material de trabajo de E. coli tau del congelador de -20 °C.
- Prepare las muestras según la Tabla 1.
- Incubar a 37 °C durante 30 min. Ultracentrífuga a 25 °C durante 60 min a 100.000 x g.
- Transfiera 120 μL de sobrenadantes que contengan tau no unido, a tubos limpios y etiquetados.
- Añadir 120 μL (el mismo volumen que el sobrenadante) de tampón de muestra 5X al pellet que contiene tau unido y mezclar bien. Transfiera la solución a tubos limpios etiquetados y mezcle bien.
- Mida la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford utilizando kits comerciales de ensayos de proteínas.
nota: Al preparar las muestras, utilice el volumen de solución (paso 1.6) para preparar las muestras de pellets y sobrenadante.
- Prepare muestras de concentración de proteína equivalente y añada tampón de carga de gel 4x SDS recién preparado que contenga DTT (400 mM).
nota: Las muestras se pueden almacenar a -20 °C en esta etapa.
- Incubar las muestras en un bloque de calor a 100 °C durante 5 min. Mezclar las muestras con un vórtice. Deje enfriar a temperatura ambiente durante ~10-15 min.
- Montar un sistema de electroforesis para ejecutar un gel de poliacrilamida al 10% de SDS-PAGE.
- Cargue 10 μg de proteína (13 μL de muestra) por pocillo en un gel de poliacrilamida al 10%. Cargue la escala de peso molecular.
- Después de cargar la muestra, conecte los electrodos positivo y negativo del sistema de electroforesis a una fuente de alimentación para mantener un voltaje constante. Inicialmente, comience con 70 V durante 20 minutos para mover las muestras de proteínas del gel de apilamiento al gel de resolución. A continuación, aumente el voltaje a 125 V y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70-120 minutos hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel.
- Una vez finalizada la electroforesis, transfiera el gel a una membrana de PVDF mediante un sistema de electrotransferencia húmeda. Transfiera durante ~ 100 min a 100 V.
- Marque la mancha haciendo un pequeño corte en el costado de la escalera de peso molecular. Use una hoja de plástico transparente y un cortador afilado para cortar la mancha.
- Bloquee la membrana en un tampón de bloqueo BSA al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente.
- Incubar el blot en una solución de anticuerpos primarios (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C durante la noche. Lave la mancha en PBST cuatro veces, durante 7 minutos cada una.
- Prepare la solución de anticuerpos secundarios correspondiente (IgG anti-ratón de cabra a 1:5.000) e incube el blot durante 90 min a temperatura ambiente. Lavar en PBST cuatro veces, durante 7 minutos cada una.
- Revele la mancha utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cubra la mancha con una envoltura de plástico transparente. Adquiera imágenes mediante un sistema de imágenes de quimioluminiscencia para la quimioluminiscencia con el software correspondiente.
Tabla 1: Preparación de la muestra para el ensayo de unión a microtúbulos.
| muestra | nombre | Microtúbulos necesarios | Proteína principal necesaria | PEM-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Control (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108,34 μl |
| número arábigo | HCT 116-curcumina 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 16,63 μl (80 μg) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30,49 μl (100 μg) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18,42 μl (100 μg) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl de tau-352 | 117 μl |
| 6 | Solo MT | 2 μl | X | 118 μl |
| | | | 120 μl cada uno |
