Aislamiento de CTC a partir de una muestra de sangre completa: un método para obtener CTC a partir de un modelo murino de cáncer colorrectal

Resumen

Fuente: Kochall, S., et al. Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe un protocolo detallado para aislar células tumorales circulantes de la muestra de sangre completa de un modelo de ratón con tumor colorrectal eutanasiado. Estos CTC aislados se pueden cultivar y utilizar para el análisis posterior previsto.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento de células tumorales circulantes a partir de muestras de sangre entera

NOTA: Obtener sangre por punción cardíaca transcutánea en ratones anestesiados, seguida de eutanasia. Idealmente, se extraen 1.000 μL de sangre en una jeringa precargada con 100 μL de un anticoagulante (ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o heparina). Utilice un anticuerpo anti-EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) para identificar las CTC. Esto funciona muy bien si se utilizan líneas celulares epiteliales humanas en el modelo de ratón. Para otras aplicaciones, es posible que se requieran diferentes anticuerpos.

1. Enriquecimiento de CTC:
   1. Llene previamente los tubos de 15 ml con un medio de gradiente de densidad de 5 ml y transfiera cuidadosamente la sangre al tubo de 15 ml.
   2. Centrifugar (30 min a 300 x g sin freno) y retirar con cuidado el sobrenadante superior.
   3. Vierta el resto en un tubo nuevo de 15 ml y centrífuga (15 min, 300 x g con freno).
   4. Recuperar la interfase que contiene las células mononucleares (desechar el resto) y lavar las células dos veces con PBS.
   5. Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de PBS/1% de EDTA y añada 4 μL de anticuerpo EpCAM. Incubar 20 min en hielo en la oscuridad.
2. Cribado y selección
   1. Prepare el siguiente tampón (en lo sucesivo denominado tampón de selección): PBS + 10% de suero fetal de ternero (FCS) + 1% de penicilina/estreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
   2. Utilice una pluma PAP para dibujar un círculo de ~1 cm en una placa de Petri estéril de 6 cm (evita que el líquido se disperse en la placa) y pipetee 700 μL de tampón de recogida en este círculo.
   3. Agregue 50 μL de suspensión celular al tampón de recolección de 700 μL dentro del círculo. Compruebe la densidad de las células con el microscopio. Divida la muestra en diferentes platos si es demasiado densa.
   4. Espere a que las celdas se calmen (~5 min).
   5. Cribar la gota de suspensión celular en busca de células teñidas (= EpCAM positivas).
   6. Una vez que se encuentra una célula, elija la célula con el micromanipulador y colóquela en un tampón de 50 μL según el análisis posterior previsto (por ejemplo, tampón de extracción de ARN o medio de cultivo).
   7. Dependiendo de los análisis posteriores previstos, aísle las células y/o el medio EpCAM negativos como controles negativos.
   8. Proceda con los análisis posteriores (por ejemplo, cultivo celular, PCR).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gradiente de densidad medio – Ficoll	StemCell - Linfopp	7801
Alexa Fluor 488 anti-humano CD326 (EpCAM) clon de anticuerpo 9C4	BioLeyenda	324210
Alexa Fluor 488 anti-ratón CD326 (EpCAM) clon de anticuerpos G8.8	BioLeyenda	118210
Placa de Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Ventilación	Greiner bio-one	628102
Microscopio de cultivo celular de fluorescencia	Leica
Micromanipulador Transferman 4r	Eppendorf
CellTram Aire	Eppendorf		Bomba de aspiración conectada al micromanipulador
Extractor de microelectrodos universal Dmz	Corporación Dagan		necesario para la fabricación de microcapilares para la aspiración de una sola célula
Capilares de vidrio prismático	Corporación Dagan
Bolígrafo PAP	Abcam
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169	búfer de picking
Suero de ternera fetal (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	búfer de picking
Penicilina/estreptomicina (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	búfer de picking
EDTA	Roth	8040.1	búfer de picking
Inmunohistoquímica
Clon 9C4 del anticuerpo antihumano CD326 (EpCAM) purificado	BioLeyenda	324201	Inmunohistoquímica de EpCAM
HRP conejo anti-ratón IgG	Abcam	AB97046	Inmunohistoquímica de EpCAM