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1. Preparación organotípica:
Preparación del gel organotípico impregnado de fibroblastos:
- Prepare una suspensión de células de fibroblastos que contenga 5 x 105 células por organotípico en DMEM suplementada con FCS al 10% y 292 μg/ml de L-glutamina.
- Componen los geles organotípicos sobre hielo en las siguientes proporciones:
- • 7 volúmenes de Colágeno Cola de Rata: Mezcla Matrigel (1:1)
- • 1 volumen de DMEM 10x filtrado
- • 1 volumen de FCS
- • 1 volumen de suspensión celular de fibroblastos que contiene 5 x 105 fibroblastos
Para 9 geles (1 ml por gel), prepare 10 ml y mezcle suavemente para evitar burbujas.
- Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 hora a 37 °C en una atmósfera humidificada para permitir que los geles se endurezcan. Después de 1 hora, agregue 1 ml de DMEM (10% FCS)/Glut encima de los geles y regrese a la incubadora durante la noche.
- Al día siguiente, aspire el medio de la parte superior de los geles y coloque 1 ml de medio que contenga 5 x 105 células epiteliales de CCR.
Preparación de láminas de nylon recubiertas de gel:
- Prepare con antelación hojas de nailon estériles esterilizadas en autoclave de 1,5 cm x 1,5 cm.
- Con pinzas estériles, coloque el número requerido de láminas de nailon en una placa de cultivo de 10 cm (por lo general, se pueden acomodar 4 hojas de nailon por placa).
- Prepare el gel sobre hielo en el siguiente orden (se requiere un volumen total de 250 μl por hoja de nylon):
- • 7 volúmenes de colágeno de cola de rata
- • 1 volumen de DMEM 10x filtrado
- • 1 volumen de FCS
- • 1 volumen de DMEM 10% FCS/Glut
- Si la solución es amarilla, neutralice añadiendo 0,1 M de NaOH en alícuotas de 50 μl hasta que la solución se vuelva rosada.
- Añadir 250 μl de esta solución a cada lámina de nailon e incubar a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 durante 30 min para permitir que el gel se asiente.
- Maquillaje 1% solución de glutaraldehído en PBS. Añadir 10 ml a cada placa de cultivo de 10 cm una vez que el gel se haya cuajado e incubar a 4 °C durante 1 hora.
- Lave las láminas de nailon 3 veces en PBS y 1 vez en DMEM (10% FCS)/Glu e incube durante la noche en DMEM/Glu a 4 °C.
Elevación de geles organotípicos en rejillas de acero para la invasión:
- Prepare previamente las rejillas de los andamios doblando las láminas de acero inoxidable en forma de trípode. Autoclave antes de usar.
- Use pinzas esterilizadas en etanol para colocar una rejilla de acero en cada pocillo de una placa de seis pocillos.
- Coloque una lámina de nailon recubierta de gel con el lado de colágeno hacia arriba, en cada rejilla.
- Transfiera con cuidado los geles organotípicos de la placa de 24 pocillos a la lámina de nailon elevada con una espátula esterilizada en etanol.
- Llene el pocillo con DMEM 10% FCS/Glut complementado con 10% FCS hasta que la lámina de nylon esté en contacto con el medio pero no sumergida. Asegúrese de que el medio no toque el gel organotípico.
- Incubar durante 14 días a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2, reemplazando el medio cada 2 días.
2. Fijación organotípica
- Retire todo el organotípico, incluida la lámina de nailon, del pozo y colóquelo sobre una película adhesiva.
- Bisectar la lámina organotípica y de nailon con un bisturí desechable limpio y fijar ambas mitades en formaldehído durante 24 horas a temperatura ambiente.
- Reemplace el formaldehído con etanol al 70% después de 24 horas y déjelo toda la noche antes de incrustarlo en parafina, seccionar y teñir.
3. Microdisección láser del margen invasivo
- Sección de hasta 10 μm de espesor en portaobjetos montados en membrana.
- Desparafinar las secciones aplicando xileno durante 1 min, luego quitar el xileno y fijar etanol al 75% durante 1 min.
- Retire el etanol y manche con una solución de Cresyl Violet al 0,125% durante 1 min. Cresyl Violet resalta las células epiteliales y permite una fácil discriminación del estroma.
- Retire Cresyl Violet y aplique etanol al 100% durante 1 minuto más antes de enjuagar con etanol al 100%. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante 30 minutos.
- Realice la microdisección láser utilizando la plataforma elegida (por ejemplo, el sistema Leica AS).
- Coloque el portaobjetos de vidrio con la sección teñida a microdiseccionar boca abajo en la platina del microscopio.
- Monte un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en el casete de recolección y agregue 50 μl de tampón de lisis celular (por ejemplo, tampón de lisis de ADN, ARN o proteínas) a la tapa en la que se recolectará el tejido microdisecado.
- Bajo visión directa, use el joystick para identificar el tejido de interés. Usando la interfaz del software, anote la sección orgánica teñida, resaltando las células que se van a microdiseccionar en el frente de invasión tumoral.
- Indique al láser que dispare, lo que debe cortar la sección resaltada e impulsar el tejido microdisecado hacia la tapa del tubo de microcentrífuga.
- Una vez que se haya recolectado suficiente material, expulse el casete de recolección, cierre el tubo de microcentrífuga y gírelo suavemente para llevar el tampón de lisis al fondo del tubo.
- Coloque las muestras en hielo hasta que se complete la microdisección. Procese las muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés.