Ensayo de citometría de tracción: un método para cuantificar la fuerza de tracción ejercida por las células cancerosas en la MEC

Abstract

Fuente: Ali, M. Y., et al. Aislamiento de células tumorales de colon humano primarias de tejidos quirúrgicos y cultivo de las mismas directamente sobre sustratos elásticos blandos para la citometría de tracción. J. Vis. Exp. (2015).

Este video describe el ensayo de microscopía de fuerza de tracción. El ensayo determina la tracción celular de las células de cáncer de colon humano en la matriz extracelular presente en un hidrogel elástico suave que tiene perlas fluorescentes incrustadas. El desplazamiento resultante de las perlas fluorescentes se mide utilizando un software adecuado.

Protocol

1. Ensayo de microscopía de fuerza de tracción

1. Calentar la solución de tripsina-EDTA al 0,25%/SDS al 10% a 37 °C en un baño de agua durante 10 minutos antes de que comiencen los experimentos de tracción.
2. Extraiga un gel (geles y vidrio de PA funcionalizados con moléculas de ECM, fibronectina humana a una concentración de 50 μg/ml) de la incubadora de cultivos celulares en un momento y lugar en la platina de microscopio invertido fluorescente (aumento de 32X).
3. Encuentra una sola celda en el campo de visión. Retire la tapa de la placa de Petri.
4. Tome una imagen de contraste de fase de la célula (p. ej., Figura 1).
5. Cambie el modo de imagen a fluorescencia y seleccione el filtro adecuado. No mueva la platina del microscopio ni la muestra durante este tiempo.
6. Tome una imagen de las perlas fluorescentes desplazadas por la tracción celular (Figura 2C).
7. Agregue 1 ml de solución de tripsina/SDS a la placa de Petri para separar la célula del gel. No mueva la platina del microscopio ni la muestra durante este tiempo. Además, tome una imagen de control de la célula para asegurar la eliminación completa del gel.
8. Tome una imagen de referencia (fuerza nula) de las cuentas después de quitar la celda.
9. Repita los pasos 1.2-1.8 para todos los demás geles.
10. Cree una pila de imágenes con ImageJ a partir de las dos imágenes adquiridas en los pasos 1.6 y 1.8 para cada caso. Para generar la pila de imágenes, utilice la siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir las imágenes: Apilas de → de imágenes → Imágenes para apilar.
11. Para obtener el campo de desplazamiento y tracción, utilice los complementos de ImageJ siguiendo los métodos publicados. Obtenga códigos y tutoriales detallados para estos complementos utilizando el siguiente enlace: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Alinee las imágenes en la pila usando el complemento 'Template Matching'. Utilice la siguiente secuencia de comandos en ImageJ después de abrir la pila de imágenes generada en el paso 1.10: Plugins → coincidencia de plantillas → alinear segmentos en la pila → OK. Guarde la pila de imágenes en consecuencia. Utilice esta nueva pila de imágenes en los pasos siguientes.
    2. Obtenga el campo de desplazamiento utilizando el complemento PIV (velocidad de imagen de partículas) (Figura 2D). Utilice la siguiente secuencia de comandos después de abrir la pila de imágenes guardada en el paso 1.11.1: Plugins → PIV → PIV iterativo (básico) → OK → Acepte este PIV y la salida → Ok. Guarde la salida PIV en el mismo directorio que en la pila de imágenes original. Utilícelo como entrada en el siguiente paso.
    3. Por último, utilice el plugin FTTC (citometría de tracción por transformada de Fourier) para obtener el mapa de tracción (Figura 2E). Utilice la siguiente secuencia de comandos: Plugins → FTTC → Insertar propiedades del material, es decir, el módulo de Young y la relación de Poisson del gel de PA → OK → Seleccione el archivo de salida PIV guardado en el paso 1.11.2 → OK. Guarde los resultados de FTTC en el mismo directorio que en la pila de imágenes y la salida PIV.

Results

Figura 1. Cultivo exitoso de células primarias de colon humano (tanto cancerosas como normales) en diferentes geles de rigidez y en placa de poliestireno. Las imágenes de contraste de fase muestran la morfología típica de (A) células tumorales y (B) células normales en diferentes sustratos de rigidez.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Lonza	17-516F
tripsina	Worthington	LS003736
acrilamida	Sigma-Aldrich	A4058
N-metilenebisacrilamida (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
Fibronectina humana	BD biociencias	354008
Perlas fluorescentes de 0,1 μm	Tecnologías para la vida	F8801
0,25% Tripsina-EDTA	Tecnologías para la vida	25200-056
Cubreobjetos de vidrio de 12 mm2	Corning	Artículo 2865-12