Ensayo de organización de citoesqueleto y adhesión focal: un método basado en inmunofluorescencia para estudiar la adhesión celular y la diseminación en sustratos

En este artículo

Resumen

Fuente: Ali, M. Y et al., Aislamiento de células tumorales de colon humano primario de tejidos quirúrgicos y cultivo de las mismas directamente sobre sustratos elásticos blandos para la citometría de tracción. J. Vis. Exp. (2015)

Este video describe la técnica de estudiar el citoesqueleto y las adherencias focales en células primarias de cáncer de colon humano para comprender sus variaciones dependiendo de la rigidez del sustrato. Este cultivo de células cancerosas sobre sustratos blandos y duros permite realizar diversas mediciones biofísicas posteriores para el pronóstico del cáncer.

Protocolo

1. Ensayos de microscopía de inmunofluorescencia

Lleve los sustratos con células a inmunoteñir a la campana laminar y retire los medios de cultivo.
Enjuague los sustratos con PBS y fije las celdas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min en RT.
Lave los sustratos con PBS tres veces (5 min cada vez). En consecuencia, incube los sustratos con un potenciador de señal de 500 μl durante 30 minutos y enjuague con PBS.
Incubar las células con el anticuerpo monoclonal anti-vinculina en una dilución de 1:250 en PBS durante 45 min en RT. A continuación, lave los sustratos con PBS 3 veces (5 min cada vez).
Incubar las muestras con el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 goatat anti-mouse IgG a una dilución 1:200 en PBS a RT durante 30 min. Lavar los sustratos con PBS 3 veces (5 min cada vez).
Para visualizar la estructura de la F-actina, incubar células con conjugados de faloidina TRITC a una concentración de 50 μg/ml durante 45 min a RT. A continuación, lave los sustratos con PBS 3 veces (5 min cada vez).
Tome imágenes de las muestras utilizando un microscopio láser de barrido confocal (Figura 1A-1D).

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Resultados

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Figura 1. Tinción inmunofluorescente de F-actina y vinculina en sustratos de gel blando y poliestireno duro.No había fibra de actina en la célula tumoral (A1) menos diseminada ni en la célula normal (A2) en geles blandos de 2 kPa. Sin embargo, las adherencias focales punteadas que contienen vinculina están presentes en las cápsulas blandas (B1-B2<...