Preparación de bloques de tejido cutáneo congelado: un protocolo para preservar muestras de melanoma cutáneo de piel dorsal murina

En este artículo

Resumen

Fuente: Moon, H., et al. Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe el protocolo detallado para aislar la piel dorsal murina que contiene melanoma, seguido de la crio-inclusión para preparar un bloque de tejido de piel congelado. El bloque de tejido crioincrustado se puede seccionar y examinar microscópicamente para estudiar la progresión del melanoma.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Procesamiento de tejidos

Aislamiento de la piel
1. Obtenga lo siguiente antes de comenzar: instrumentos de necropsia, papel de filtro y toallas de papel.
2. Eutanasiar a los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados y confirmar la muerte antes de proceder.
3. Con una cortadora de pelo, afeita el vello de la zona dorsal de la piel. Cepille ligeramente el área con un pañuelo sin pelusa para despejar el área.
4. Haz una pequeña incisión con unas tijeras afiladas justo por encima de la base de la cola.
5. Inserte unas tijeras grandes y romas en la incisión y separe los tejidos conectivos subdérmicos.
6. Aísle cuidadosamente la región de la piel de interés cortando con tijeras afiladas a lo largo del borde del tejido.
7. Coloque el pañuelo de papel sobre una toalla de papel limpia y use pinzas sin filo para estirar la piel de modo que se adhiera a la toalla y esté tensa. Este paso sirve para proporcionar un soporte adicional para el tejido para que pueda ser manipulado y procesado mientras mantiene su forma.
  nota: Tenga cuidado de manipular solo las regiones externas del tejido de la piel, ya que las pinzas pueden causar daños en la piel que se pueden ver histológicamente.
Fijación de tejidos
1. Dobla un pedazo de papel de filtro por la mitad y etiquétalo adecuadamente. Coloque la piel junto con el respaldo de una toalla de papel en el papel doblado inmediatamente adyacente al pliegue, asegurándose de que la muestra esté lisa y no doblada o arrugada. Selle el papel de filtro grapando los lados abiertos y luego recórtelo para que el papel restante se pueda usar para muestras futuras><. nota: Este paso se realiza para que la piel conserve su forma durante la fijación.
2. Sumerja completamente la muestra de tejido en formol tamponado neutro al 10% durante 3 a 5 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
3. Después de la fijación, retire las muestras de formalina, lávelas con agua desionizada (2 x 5 min cada una) y proceda a hacer bloques de tejido. Retire con cuidado cualquier material residual del tejido de la piel (es decir, papel residual).
Fabricación de bloques de tejido congelado (Figura 1)
1. Recorte los bordes de la muestra de piel para que no queden dentados y luego haga 3 cortes sagitales. El ancho de estas tiras no debe ser mayor que la altura del criomold (5 mm). A continuación, se realizan cortes transversales para tener trozos de piel que no sean más largos que el ancho del criomold (20 mm) y que se puedan incrustar. Repita con la mitad restante de la piel dorsal, o guarde el tejido para otros usos (alternativamente, guarde la mitad antes de la fijación).
  nota: Es importante mantener las piezas de piel en la orientación adecuada.
2. Oriente el criommolda (25 x 20 x 5 mm³) en orientación vertical y coloque de 4 a 5 piezas de piel encima de la OCT. Una vez que todas las piezas estén en su lugar, use 2 pares de pinzas finas para llevar el borde largo de la piel al fondo del molde criogénico. La piel ahora debe estar erguida en la OCT perpendicular a la base del molde. Tenga cuidado de minimizar la formación de bolsas de aire dentro de la OCT durante este paso (Figura 1).
3. Llene el molde con OCT hasta el segundo labio y colóquelo sobre la superficie plana de hielo seco. Use pinzas para ajustar cualquier pieza de piel que pueda haberse movido durante la transferencia a medida que el bloque comienza a congelarse. Una vez que la capa inferior se solidifica, la manipulación de los tejidos será imposible.
4. Corte portaobjetos de 8-10 μm para su análisis.
Fabricación de bloques de tejido con inclusión en parafina fija en formalina (FFPE)
1. Coloque 2 piezas de piel fijada en un casete etiquetado y deshidrate en concentraciones crecientes de etanol (75% de etanol durante 30 min, 85% durante 30 min, 90% durante 30 min, 95% durante 30 min, 100% durante 2x 30 min, xileno o sustituto de xileno para 2x 30 min). Incubar con parafina a 58-60° C, primero durante 30 min y luego toda la noche.
2. Incrustar el tejido en un molde de papel tisú de acero inoxidable de 24 x 24^mm2 con parafina líquida y solidificar a -5 °C. La orientación del tejido debe ser similar a la de los bloques de tejido congelado para que se puedan visualizar secciones longitudinales a través de múltiples folículos pilosos (Figura 1).
3. Una vez que la parafina se haya solidificado, retire el molde y córtelo en secciones de 5-10 μm para su análisis.

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Resultados

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Figura 1: Aislamiento de tejido cutáneo y crio-incrustación. Después de la eutanasia, afeitar la región de interés de la piel dorsal del ratón e incrustar la piel en un criomold que contenga OCT. La línea punteada del ratón representa la línea media. Por lo general, se pueden aislar 3 o 4 piezas de piel con el segmento de línea 3-4 a lo largo de la línea media; Una de esas piezas se indica con un rec...