Modelado de xenoinjertos derivados de pacientes: una técnica para generar modelos de ratón de melanoma

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Procesamiento de tejido tumoral para la implantación en ratones

1. Escisión quirúrgica o procesamiento de tejido de biopsia quirúrgica
   1. Transfiera el tejido a una placa de Petri estéril y separe el tejido tumoral del tejido normal circundante tanto como sea posible.
   2. Extirpar el tejido necrótico (generalmente identificado como tejido blanquecino pálido ubicado en el centro del tumor) del tumor restante tanto como sea posible.
   3. Utilice un bisturí para subdividir un fragmento inicial de tumor en trozos aproximadamente iguales (~3 mm x 3 mm) para la implantación quirúrgica de ratones (Figura 1).
   4. Opcionalmente, si se dispone de suficiente tejido tumoral, congele el tejido para realizar ensayos posteriores (secuenciación de ARN [RNASeq], secuenciación del exoma completo [WES], etc.).
   5. Haga una suspensión tumoral picando el tejido tumoral con una técnica de cuchilla cruzada con dos hojas de bisturí. Picar los trozos del tumor lo más finamente posible para formar una suspensión, que ahora está lista para la implantación quirúrgica en ratones.
   6. Alternativamente, si el tejido tumoral es demasiado duro para la disociación mecánica, use un procedimiento de disociación por digestión para formar una suspensión similar a un gel y una suspensión unicelular para la implantación y/o inyección.
      1. Pica los trozos del tumor lo más finamente posible para formar una suspensión.
      2. Coloque la suspensión en un tubo de 50 mL con solución salina equilibrada de Hank fría (HBSS)^-/- (sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺); luego, centrifugar el pellet a 220 x g durante 4 min a 4 °C.
      3. Vuelva a suspender la suspensión en 10 mL de medio digestivo fresco calentado (200 U/mL de colagenasa IV + 5 mM de CaCl₂ + 50 U/mL de DNasa en HBSS^-/-) por 1 g de tejido tumoral.
      4. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos y mezcle enérgicamente cada 5 minutos con una pipeta desechable.
      5. Lavar con hasta 50 mL de ^HBSS-/-; luego, centrifugar a 220 x g durante 4 min a 4 °C.
      6. Añadir 5 mL de TEG precalentado (0,025% tripsina + 40 μg/mL de etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético [EGTA] + 10 μg/mL de alcohol polivinílico [PVA]) por 1 g de tejido tumoral, resuspender/agitar suavemente y colocar el tubo a 37 °C durante 2 min sin mezclar.
      7. Añadir al menos 1 volumen igual de medio de tinción en frío (1% albúmina sérica bovina [BSA] + 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico [HEPES] + 1x penicilina-estreptomicina en medio L15) para enfriar la tripsina y centrifugar a 220 x g durante 4 min a 4 °C.
      8. Vuelva a suspender la muestra en 10 mL de medio de tinción por 1 g de tejido tumoral y fíltrela a través de un filtro de células de 40 μm para obtener una suspensión unicelular para inyección en ratones (Figura 1).
      9. La suspensión que queda en la parte superior del filtro de células también se puede recolectar para la implantación quirúrgica de ratones.
2. Implantación e inyección de tumores en ratones
   1. Implantación de tejido de escisión quirúrgica o biopsia quirúrgica
      nota: Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos sean estériles mediante el autoclave o el uso de instrumentos desechables preesterilizados.
      1. Afeitar el pelo de la parte inferior de la espalda de los ratones machos o hembras de NSG de 6-8 semanas, dejando un área de aproximadamente 1,5 cm x 3 cm sin pelo. Anestesiar a los ratones con isoflurano y confirmar apretando suavemente el pie como prueba de capacidad de respuesta. Use ungüento veterinario en sus ojos para prevenir la sequedad.
      2. Coloque ratones individuales en una almohadilla térmica en el cono de la nariz de la máquina de anestesia, frote el área afeitada con clorhexidina. Luego, rocíe con etanol al 70% y deje que se evapore.
      3. Prepare trozos o divida la suspensión tumoral en una placa de Petri en montículos individuales para la implantación quirúrgica (es decir, en tres montículos iguales si se va a implantar en 3 ratones).
      4. Con la hoja del bisturí, haga una incisión de aproximadamente 5 mm de largo en el centro de la parte posterior del ratón, tome un par de pinzas y levante la piel en el lado de la incisión opuesto al operador.
      5. Tome las tijeras en la otra mano y separe la piel de la capa muscular cortando suavemente la membrana fascial con pequeños cortes de tijera, creando así un "bolsillo" para el tejido tumoral.
      6. Recoja un trozo de tumor o un montículo individual de tejido de lechada tumoral con la hoja del bisturí y coloque suavemente el tejido en el bolsillo creado.
      7. Administrar 100 μL de matriz extracelular artificial en el montículo de tejido tumoral en la bolsa.
      8. Con dos pares de pinzas, tire de la incisión en ambos extremos para que los bordes de la herida se acerquen y cierre la herida aplicando uno o dos clips para heridas.
      9. Inyectar por vía subcutánea 1-5 mg/kg de meloxicam como analgésico en ratones después de la cirugía.
      10. Saca al ratón del cono de la nariz y colócalo de nuevo en su jaula original; observa al ratón mientras se despierta. No regrese a una jaula hasta que esté completamente recuperado.
      11. Retire los clips de la herida después de aproximadamente 7 días. Si la cicatrización no es completa después de 7 días, deje la pinza para heridas durante uno o dos días adicionales.
          nota: Si se utiliza una suspensión de una sola célula de la escisión quirúrgica o del procesamiento de tejido de biopsia quirúrgica, se mezclará con la matriz extracelular artificial (en una proporción de 1:1) para la inyección en ratones.
   2. Inyección de FNA o tejido de biopsia con aguja gruesa
      1. Coloque un mouse NSG en un bastidor de rejilla de acero, sostenga el mouse firmemente por la cola y tire suavemente del mouse hacia atrás. Agarrará la rejilla con sus patas delanteras con firmeza. Alternativamente, sujete el mouse en la mano no dominante y deje visible el área del flanco.
      2. Desinfecte la piel del flanco con hisopos de preparación con alcohol. Inyecte lenta y constantemente el contenido de la jeringa debajo de la piel del ratón.
      3. Saca la aguja y vuelve a colocar al ratón en su jaula.
3. Controlar el crecimiento tumoral
   1. Monitoree a los ratones una vez a la semana para verificar si hay tumores palpables.
   2. Una vez que los tumores tengan un tamaño medible (aproximadamente 50^mm3), use un calibrador para registrar las dimensiones del tumor. Utilice la siguiente fórmula para calcular los volúmenes tumorales: (ancho x ancho x largo) / 2.
   3. Extraer el tumor una vez que el volumen tumoral alcanza alrededor de 1,5^cm3 (aproximadamente 4-10 semanas). El tumor ahora se llama pasaje de ratón 1 (MP1).

Figura 1: Métodos alternativos de implantación.(A) Los tumores se pueden procesar en trozos, en una suspensión en suspensión o como una suspensión unicelular. (B) Los tres métodos permitirán el crecimiento de tumores in vivo. Aquí se muestran ratones a los que se les implantó el tumor por vía subcutánea y se les tomaron imágenes 12 días después de la implantación. (C) Se muestran las curvas de crecimiento tumoral de los ratones inyectados con uno de los tres métodos de implantación. N = 5 por brazo; Las barras de error son un error estándar.