>1. Generación de esferoides de melanoma en 3D mediante el método de caída colgante
<ol>
	<li>Cultive células de melanoma (por ejemplo, 451-LU o cualquier línea celular de melanoma de interés) de acuerdo con los protocolos generales, utilizando RPMI que contenga un 10% de FCS.
	<ol>
		<li>Para generar esferoides de melanoma de tamaño y calidad similares, lavar las células de melanoma en PBS, añadir 5 mL de 1x tripsina-EDTA en PBS a las células en un matraz de cultivo celular T175 e incubar durante 3 a 5 min a temperatura ambiente (RT). Neutraliza la tripsina añadiendo 5 mL RPMI/10% FCS. Recolectar las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet de células en RPMI/FCS a una concentración final de 10.000 células/mL según se determine mediante el recuento en un hemocitómetro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque 40 x 25 μL (= 250 células) de la suspensión celular en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo celular estéril no adhesiva (Ø 10 cm) utilizando una pipeta electrónica múltiple. Con un movimiento rápido pero suave, gire la tapa y colóquela en la placa de cultivo celular respectiva que contenga 5 mL de PBS.
	<ol>
		<li>Cultivo de "placas colgantes" en una incubadora de células a 37 °C y 5% de CO2 durante 10-14 días, dependiendo del tipo de célula utilizado. 
		nota: Las células de la fase de crecimiento del melanoma metastásico suelen crecer más rápido y forman esferoides más sólidos en la gota colgante en comparación con las células de melanoma derivadas de la fase de crecimiento radial o vertical. Para la evaluación individual, observe el crecimiento de los esferoides bajo un par de binoculares o bajo un microscopio óptico (aumento de 4X). Por lo general, los esferoides se vuelven detectables después de 48 h bajo un par de binoculares o bajo un microscopio óptico (aumento de 4X). Después de 10-14 días, son visibles sin ningún dispositivo de aumento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cinco días después de la detección inicial de la gota, agregue 10 μL de medio RPMI/10% FCS fresco a cada gota. Posteriormente, cambie 10 μL de medio cada dos días. El uso de un dispensador electrónico es muy útil en este paso.</li>
	<li>Dependiendo del tipo de célula, coseche los esferoides después de 10-15 días. Enjuague cuidadosamente los esferoides de la tapa de la placa de cultivo de células colgantes con PBS. Recoja de 10 a 20 esferoides en una placa de cultivo celular estéril y no adhesiva. Elimine con cuidado el exceso de PBS con una pipeta Pasteur. 
	nota: El período de cultivo depende de la fase de crecimiento tumoral de las células de melanoma cuando se derivaron inicialmente, por ejemplo, los esferoides derivados de células 451-LU crecen hasta aproximadamente 500 μm de diámetro dentro de los 12 días posteriores al cultivo en la gota colgante.</li>
</ol>

No se han declarado conflictos de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>albúmina sérica fetal (FCS) </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Añadir un 10 % al medio de cultivo celular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina-EDTA </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>1X diluido en PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI </td>
			<td> Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Para el cultivo de líneas celulares de melanoma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

método de la gota colgante: una técnica para generar esferoides de melanoma en 3d

Hanging Drop Method: A Technique to Generate 3D Melanoma Spheroids

Fuente: Müller, I. et al., <a href="https://www.jove.com/v/57500"> Un modelo de piel esferoide de melanoma organotípico en 3D</a>. J. Vis. Exp. (2018)
Este video describe la técnica de generación de esferoides tridimensionales a través del método de gota colgante utilizando células de melanoma. El modelo esferoide organotípico de melanoma tridimensional (3D) generado in vitro puede describir la arquitectura in vivo del melanoma maligno y puede proporcionar información sobre las interacciones intratumorales.

Método de la gota colgante: una técnica para generar esferoides de melanoma en 3D

Fuente: Müller, I. et al., Un modelo de piel esferoide de melanoma organotípico en 3D. J. Vis. Exp. (2018)
Este video describe la técnica de generar ...

- Los esferoides son modelos tridimensionales de cultivo celular in vitro que imitan la arquitectura tumoral in vivo y ayudan a estudiar las interacciones intratumorales. Para configurar el cultivo, primero prepare una suspensión unicelular de células de melanoma en su medio apropiado. A continuación, localice pequeños volúmenes de esta suspensión celular, suficientemente separados en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo estéril y no adhesiva. Invierta con cuidado la tapa y colóquela en la base de la placa de cultivo que contiene PBS para crear una cámara de hidratación. Incubar la placa en condiciones adecuadas.
La humedad del PBS evita la evaporación de los medios de las gotas colgantes. Refresque las gotas reemplazando unos pocos microlitros de medio. Debido a la tensión superficial, las gotas mantienen su forma esférica y permanecen suspendidas de la superficie interna de la placa. Las fuerzas gravitacionales facilitan que las células permanezcan en suspensión sin extenderse, sino que se agreguen para formar esferoides tridimensionales dentro de las gotas. Finalmente, enjuague las gotas con PBS para recolectar los esferoides. Recójalos en una placa de cultivo no adhesiva.
En el siguiente protocolo, demostraremos la generación de esferoides tridimensionales de células de melanoma 451-LU mediante el método de gota colgante.
- Para empezar, cultivar células de melanoma 451-LU utilizando medio RPMI que contenga un 10% de FCS, de acuerdo con los protocolos generales de cultivo celular. Para generar esferoides de melanoma, lave las células de melanoma cultivadas en PBS. A continuación, añade 5 mililitros de 1x Tripsina-EDTA en PBS. Incubar durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Añadir 5 mililitros de RPMI que contengan un 10% de FCS para neutralizar la tripsina. Luego, transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos para recolectar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en RPMI que contenga un 10% de FCS.
A continuación, cuente las células y diluya la suspensión celular hasta una concentración final de 10.000 células por mililitro. Utilice una pipeta electrónica múltiple para hacer puntos de suspensión celular de 40 x 25 microlitros en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo celular estéril y no adhesiva de 10 centímetros.
A continuación, dé la vuelta a la tapa con un movimiento rápido y suave y colóquela en la placa de cultivo celular que contiene 5 mililitros de PBS. Cultive los platos colgantes a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante 10 a 14 días.
Cinco días después de la detección inicial de gotas, use un dispensador electrónico para agregar 10 microlitros de RPMI que contengan 10% de FCS a cada gota. Después de 10 a 15 días, coseche los esferoides enjuagándolos suavemente de la tapa con PBS. Recoja los esferoides en una placa de cultivo celular nueva y no adhesiva.

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Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
albúmina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	Añadir un 10 % al medio de cultivo celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X diluido en PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	Para el cultivo de líneas celulares de melanoma