Generación de reconstrucciones organotípicas de piel completa: un procedimiento para establecer un modelo de piel en 3D utilizando muestras de piel humana

Resumen

Fuente: Müller, I. et al. Un modelo organotípico de piel esferoide de melanoma en 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe el protocolo detallado para generar reconstrucciones organotípicas de piel en 3D in vitro para estudiar la progresión del melanoma. Este modelo de piel imita tanto la arquitectura como la complejidad multicelular de los órganos in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Aislamiento de queratinocitos primarios de la epidermis

1. Lave el tejido epidérmico con PBS. Corta la epidermis en trozos más pequeños (1 mm,²) y recógelos en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 mL 1x Tripsina-EDTA (precalentado a 37 °C) e incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 °C. Vortexear la suspensión de tejido cada 2 min.
2. Detenga la rea....

Resultados

Figura 1: Cultivo de reconstrucciones organotípicas de piel en 3D sumergidas con medio y en la interfaz aire-líquido. En el día 0, los queratinocitos primarios se siembran en la parte superior del compartimento dérmico que consta de fibroblastos primarios incrustados en una matriz de colágeno tipo I. Las reconstrucciones de piel en 3D permanecen cultivadas sumergidas con EGM durante 7 días, se despre.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
albúmina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	añadir un 10 % al medio de cultivo celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X diluido en PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	para el cultivo de fibroblastos primarios
Dispasa	Tecnologías de vida de Gibco	17105041	2U/ml, disolver en PBS
Colágeno tipo I	BD Biociencias	354249	Por lo general, de la cola de rata, la concentración debe ser de 3,5-4 mg / ml
Insertos de 24 pocillos Nunclon	Nunc	140629	Tamaño de poro de 8 μm; use insertos de pie, no colgantes
colador de células	Halcón BD	352360	amarillo
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750060	disolver en PBS
Medio de queratincitación Keralife	Sistemas de celdas		no agregue FCS ni antibióticos
colagenasa	SERVA	17454	Grado estándar NB4
Queratinocitos humanos juveniles	Sistemas de celdas	FC-0007	Alternativa a la preparación propia del prepucio juvenil
Fibroblastos humanos juveniles	Sistemas de celdas	FC-0001	Alternativa a la preparación propia del prepucio juvenil
FEAG	Tecnologías de vida de Gibco	13247-051	añadir 10 ng/ml solo para la generación de medio EGM
Cloruro de calcio	Productos químicos Merck	Artículo 2381	añadir 1,9 mM para la generación de EGM y 3,8 mM para MM medio
Ácido selénico	Alfa Aesar	18851	añadir 53 nM para la generación de medios EGM y MM
insulina	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	añadir 5 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
etanolamina	Sigma-Aldrich	E-0135	añadir 0,1 mM para la generación de medio EGM y MM
P-Etanolamina	Sigma-Aldrich	P-0503	añadir 0,1 mM para la generación de medio EGM y MM
Holo-Transferrina	Sigma-Aldrich	T-0665	añadir 5 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
triyodotironina	Sigma-Aldrich	T-6397	añadir 20 pM para la generación de medio EGM y MM
hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H-088816	añadir 0,4 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
progesterona	Sigma-Aldrich	P-8783	agregue 10 nM solo para la generación de medio EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	añadir 15 mM para la generación de medio EGM y MM
serina	Sigma-Aldrich	S-4311	añadir 1 mM para la generación de medio EGM y MM
Cloruro de colina	Sigma-Aldrich	C-7017	añadir 0,64 mM para la generación de medio EGM y MM
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lote 086K0361	añadir un 2 % para la generación de medios EGM y MM
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	añadir 0,18 mM para la generación de medio EGM y MM
L-Glutamina	PromoCell	C-42209	añadir 7,25 mM para la generación de medio EGM y MM
Cloruro de estroncio	Sigma-Aldrich	255521	añadir 1 mM para la generación de medio EGM y MM