Generación de reconstrucciones organotípicas de piel completa: un procedimiento para establecer un modelo de piel en 3D utilizando muestras de piel humana

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Aislamiento de queratinocitos primarios de la epidermis

1. Lave el tejido epidérmico con PBS. Corta la epidermis en trozos más pequeños (1 mm,²) y recógelos en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 mL 1x Tripsina-EDTA (precalentado a 37 °C) e incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 °C. Vortexear la suspensión de tejido cada 2 min.
2. Detenga la reacción enzimática agregando 1 mL de suero fetal de ternera (FCS). Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de plástico de 10 ml durante 4 minutos. Trate de evitar la formación de burbujas y espuma.
3. Pipetear la suspensión celular en un filtro celular (tamaño de poro de 100 μm), colocado encima de un tubo cónico nuevo de 50 mL y enjuagar 3 veces con 5 mL de PBS. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo de 2-6 mL que contenga gentamicina al 1% (v/v). Determine el número de células manualmente contando las células en un hemocitómetro y siembre 6 x 10⁵ células en un matraz de cultivo celular T75.

>2. Aislamiento de fibroblastos primarios de la dermis

1. Cortar el tejido dérmico en trozos más pequeños (1^mm2) y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 mL de solución de colagenasa (5 U/mL en PBS⁺) e incubar durante 45 min en baño maría a 37 °C. Centrifugar la mezcla de trozos de tejido y células a 200 x g durante 5 min.
2. Lavar el pellet celular dos veces con 10 mL de DMEM que contenga 4,5 g/L de glucosa y L-Glutamina, pero sin L-Piruvato. Finalmente, vuelva a suspender las piezas de tejido en 2 mL de DMEM que contengan 1% (v/v) de gentamicina y 10% de FCS. Transfiéralos a un matraz de cultivo celular T25 e incube en una incubadora celular a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche.
   NOTA: El pequeño volumen permite que los fibroblastos migren fuera de los restos de tejido y los obliga a adherirse al matraz de cultivo.
3. A la mañana siguiente, añadir otros 6 mL de DMEM/Gentamicina/FCS e incubar durante 2-3 días a 37 °C hasta que las células hayan alcanzado el 80-90% de confluencia.

>3. Generación del compartimento dérmico de las reconstrucciones organotípicas de piel completa

1. Genere modelos de piel utilizando insertos de membrana microporosa de celdas de 24 pocillos (tamaño de poro de 8 μm) colocados en placas de 24 pocillos.
   nota: Asegúrese de no usar insertos colgantes pero de pie, porque se colocarán en una placa de 6 pocillos para el cultivo de aire y líquido en una etapa posterior.
2. Prepare la solución de neutralización en gel (GNL), así como los medios de cultivo denominados MM y los medios de crecimiento endotelial (EGM). Para prevenir la coagulación, almacene el colágeno tipo I (generalmente de la cola de rata, 3,5-4 mg / mL en ácido acético 0,02 N) en hielo hasta su uso porque comienza a gelificarse en RT.
3. Vuelva a suspender 1 x 10⁵ fibroblastos por inserto en GNL y mezcle rápidamente la suspensión celular con colágeno en una proporción de 1:3 en un volumen final de 500 μL/inserto. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar la formación de burbujas, ya que las burbujas pueden perjudicar la calidad de la reconstrucción de la piel.
4. Deje que los geles dérmicos individuales se asienten manteniéndolos sin medio a RT durante 30 minutos en una campana estéril. A continuación, cubrir cada gel con DMEM que contenga 4,5 g/L de glucosa, 1% de L-glutamina, 10% de FCS y sin L-piruvato, e incubar durante la noche a 37 °C.

>4. Generación del compartimento epidérmico de las reconstrucciones organotípicas de la piel completa

1. Al día siguiente, retire el medio de los geles dérmicos y equilibre con medios EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL de gentamicina) durante 2 h a 37 °C. Retire el medio y siembre con cuidado 1 x 10⁵ queratinocitos resuspendidos en 100 μL EGM sobre el gel dérmico.
2. Incubar las reconstrucciones durante 1,5 h a 37 °C para permitir que los queratinocitos se adhieran al compartimento dérmico.
   nota: Durante este tiempo de incubación, los geles comenzarán a encogerse debido a la contracción inducida por fibroblastos y, por lo tanto, al menos parcialmente se desprenderán de las paredes del inserto.
3. Cubra los equivalentes cutáneos con aproximadamente 800 μL de EGM y retire con cuidado el gel residual de la pared del inserto con una pequeña punta de pipeta (blanca). Cultive los equivalentes de piel sumergidos en EGM durante 7 días en una incubadora celular a 37 °C, 5% CO₂, y cambie el medio cada dos días.
   nota: Durante este tiempo, los equivalentes de piel se encogerán significativamente.

>5. Cultivo aire-líquido de reconstrucciones organotípicas de piel completa

1. En el día 8, transfiera cada inserto a un pocillo individual de una placa de 6 pocillos. Solo agregue 1.2-1.4 mL de medio MM a cada pocillo, de modo que la reconstrucción de la piel se suministre con medio desde el fondo del pocillo pero no se cubra con el medio.
   nota: El cultivo en la interfaz aire-líquido permite la estratificación de la parte epidérmica y el establecimiento de una capa córnea completa (estrato córneo).
2. Durante los próximos 10 a 17 días, cambie el medio como se indica en la sección 5.1 cada dos días. Durante este período, agregue drogas u otros estímulos según sea necesario al medio. Retire con cuidado la reconstrucción completa de la piel del inserto de la membrana microporosa con pinzas curvas para un análisis posterior, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico (Figura 1).

Figura 1: Cultivo de reconstrucciones organotípicas de piel en 3D sumergidas con medio y en la interfaz aire-líquido. En el día 0, los queratinocitos primarios se siembran en la parte superior del compartimento dérmico que consta de fibroblastos primarios incrustados en una matriz de colágeno tipo I. Las reconstrucciones de piel en 3D permanecen cultivadas sumergidas con EGM durante 7 días, se desprenden de la pared del inserto y comienzan a encogerse. En el día 8, los insertos se transfieren a 6 pocillos y se cultivan en la interfaz aire-líquido para permitir la estratificación epidérmica.