Generación de reconstrucciones organotípicas de piel completa: un procedimiento para establecer un modelo de piel en 3D utilizando muestras de piel humana

Resumen

Fuente: Müller, I. et al. Un modelo organotípico de piel esferoide de melanoma en 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe el protocolo detallado para generar reconstrucciones organotípicas de piel en 3D in vitro para estudiar la progresión del melanoma. Este modelo de piel imita tanto la arquitectura como la complejidad multicelular de los órganos in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Aislamiento de queratinocitos primarios de la epidermis

1. Lave el tejido epidérmico con PBS. Corta la epidermis en trozos más pequeños (1 mm,²) y recógelos en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 mL 1x Tripsina-EDTA (precalentado a 37 °C) e incubar durante 5 min en un baño de agua a 37 °C. Vortexear la suspensión de tejido cada 2 min.
2. Detenga la reacción enzimática agregando 1 mL de suero fetal de ternera (FCS). Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de plástico de 10 ml durante 4 minutos. Trate de evitar la formación de burbujas y espuma.
3. Pipetear la suspensión celular en un filtro celular (tamaño de poro de 100 μm), colocado encima de un tubo cónico nuevo de 50 mL y enjuagar 3 veces con 5 mL de PBS. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo de 2-6 mL que contenga gentamicina al 1% (v/v). Determine el número de células manualmente contando las células en un hemocitómetro y siembre 6 x 10⁵ células en un matraz de cultivo celular T75.

>2. Aislamiento de fibroblastos primarios de la dermis

1. Cortar el tejido dérmico en trozos más pequeños (1^mm2) y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 mL de solución de colagenasa (5 U/mL en PBS⁺) e incubar durante 45 min en baño maría a 37 °C. Centrifugar la mezcla de trozos de tejido y células a 200 x g durante 5 min.
2. Lavar el pellet celular dos veces con 10 mL de DMEM que contenga 4,5 g/L de glucosa y L-Glutamina, pero sin L-Piruvato. Finalmente, vuelva a suspender las piezas de tejido en 2 mL de DMEM que contengan 1% (v/v) de gentamicina y 10% de FCS. Transfiéralos a un matraz de cultivo celular T25 e incube en una incubadora celular a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche.
   NOTA: El pequeño volumen permite que los fibroblastos migren fuera de los restos de tejido y los obliga a adherirse al matraz de cultivo.
3. A la mañana siguiente, añadir otros 6 mL de DMEM/Gentamicina/FCS e incubar durante 2-3 días a 37 °C hasta que las células hayan alcanzado el 80-90% de confluencia.

>3. Generación del compartimento dérmico de las reconstrucciones organotípicas de piel completa

1. Genere modelos de piel utilizando insertos de membrana microporosa de celdas de 24 pocillos (tamaño de poro de 8 μm) colocados en placas de 24 pocillos.
   nota: Asegúrese de no usar insertos colgantes pero de pie, porque se colocarán en una placa de 6 pocillos para el cultivo de aire y líquido en una etapa posterior.
2. Prepare la solución de neutralización en gel (GNL), así como los medios de cultivo denominados MM y los medios de crecimiento endotelial (EGM). Para prevenir la coagulación, almacene el colágeno tipo I (generalmente de la cola de rata, 3,5-4 mg / mL en ácido acético 0,02 N) en hielo hasta su uso porque comienza a gelificarse en RT.
3. Vuelva a suspender 1 x 10⁵ fibroblastos por inserto en GNL y mezcle rápidamente la suspensión celular con colágeno en una proporción de 1:3 en un volumen final de 500 μL/inserto. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar la formación de burbujas, ya que las burbujas pueden perjudicar la calidad de la reconstrucción de la piel.
4. Deje que los geles dérmicos individuales se asienten manteniéndolos sin medio a RT durante 30 minutos en una campana estéril. A continuación, cubrir cada gel con DMEM que contenga 4,5 g/L de glucosa, 1% de L-glutamina, 10% de FCS y sin L-piruvato, e incubar durante la noche a 37 °C.

>4. Generación del compartimento epidérmico de las reconstrucciones organotípicas de la piel completa

1. Al día siguiente, retire el medio de los geles dérmicos y equilibre con medios EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/mL de gentamicina) durante 2 h a 37 °C. Retire el medio y siembre con cuidado 1 x 10⁵ queratinocitos resuspendidos en 100 μL EGM sobre el gel dérmico.
2. Incubar las reconstrucciones durante 1,5 h a 37 °C para permitir que los queratinocitos se adhieran al compartimento dérmico.
   nota: Durante este tiempo de incubación, los geles comenzarán a encogerse debido a la contracción inducida por fibroblastos y, por lo tanto, al menos parcialmente se desprenderán de las paredes del inserto.
3. Cubra los equivalentes cutáneos con aproximadamente 800 μL de EGM y retire con cuidado el gel residual de la pared del inserto con una pequeña punta de pipeta (blanca). Cultive los equivalentes de piel sumergidos en EGM durante 7 días en una incubadora celular a 37 °C, 5% CO₂, y cambie el medio cada dos días.
   nota: Durante este tiempo, los equivalentes de piel se encogerán significativamente.

>5. Cultivo aire-líquido de reconstrucciones organotípicas de piel completa

1. En el día 8, transfiera cada inserto a un pocillo individual de una placa de 6 pocillos. Solo agregue 1.2-1.4 mL de medio MM a cada pocillo, de modo que la reconstrucción de la piel se suministre con medio desde el fondo del pocillo pero no se cubra con el medio.
   nota: El cultivo en la interfaz aire-líquido permite la estratificación de la parte epidérmica y el establecimiento de una capa córnea completa (estrato córneo).
2. Durante los próximos 10 a 17 días, cambie el medio como se indica en la sección 5.1 cada dos días. Durante este período, agregue drogas u otros estímulos según sea necesario al medio. Retire con cuidado la reconstrucción completa de la piel del inserto de la membrana microporosa con pinzas curvas para un análisis posterior, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Cultivo de reconstrucciones organotípicas de piel en 3D sumergidas con medio y en la interfaz aire-líquido. En el día 0, los queratinocitos primarios se siembran en la parte superior del compartimento dérmico que consta de fibroblastos primarios incrustados en una matriz de colágeno tipo I. Las reconstrucciones de piel en 3D permanecen cultivadas sumergidas con EGM durante 7 días, se despre...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
albúmina sérica fetal (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	añadir un 10 % al medio de cultivo celular
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X diluido en PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	para el cultivo de fibroblastos primarios
Dispasa	Tecnologías de vida de Gibco	17105041	2U/ml, disolver en PBS
Colágeno tipo I	BD Biociencias	354249	Por lo general, de la cola de rata, la concentración debe ser de 3,5-4 mg / ml
Insertos de 24 pocillos Nunclon	Nunc	140629	Tamaño de poro de 8 μm; use insertos de pie, no colgantes
colador de células	Halcón BD	352360	amarillo
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15750060	disolver en PBS
Medio de queratincitación Keralife	Sistemas de celdas		no agregue FCS ni antibióticos
colagenasa	SERVA	17454	Grado estándar NB4
Queratinocitos humanos juveniles	Sistemas de celdas	FC-0007	Alternativa a la preparación propia del prepucio juvenil
Fibroblastos humanos juveniles	Sistemas de celdas	FC-0001	Alternativa a la preparación propia del prepucio juvenil
FEAG	Tecnologías de vida de Gibco	13247-051	añadir 10 ng/ml solo para la generación de medio EGM
Cloruro de calcio	Productos químicos Merck	Artículo 2381	añadir 1,9 mM para la generación de EGM y 3,8 mM para MM medio
Ácido selénico	Alfa Aesar	18851	añadir 53 nM para la generación de medios EGM y MM
insulina	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	añadir 5 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
etanolamina	Sigma-Aldrich	E-0135	añadir 0,1 mM para la generación de medio EGM y MM
P-Etanolamina	Sigma-Aldrich	P-0503	añadir 0,1 mM para la generación de medio EGM y MM
Holo-Transferrina	Sigma-Aldrich	T-0665	añadir 5 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
triyodotironina	Sigma-Aldrich	T-6397	añadir 20 pM para la generación de medio EGM y MM
hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H-088816	añadir 0,4 μg/ml para la generación de medio EGM y MM
progesterona	Sigma-Aldrich	P-8783	agregue 10 nM solo para la generación de medio EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	añadir 15 mM para la generación de medio EGM y MM
serina	Sigma-Aldrich	S-4311	añadir 1 mM para la generación de medio EGM y MM
Cloruro de colina	Sigma-Aldrich	C-7017	añadir 0,64 mM para la generación de medio EGM y MM
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lote 086K0361	añadir un 2 % para la generación de medios EGM y MM
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	añadir 0,18 mM para la generación de medio EGM y MM
L-Glutamina	PromoCell	C-42209	añadir 7,25 mM para la generación de medio EGM y MM
Cloruro de estroncio	Sigma-Aldrich	255521	añadir 1 mM para la generación de medio EGM y MM