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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de células B16-BL6
- Retire las placas de cultivo celular de la incubadora a 37 grados y colóquelas en una campana estéril. Las placas deben tener aproximadamente un 70% de confluente con células de melanoma murino B16-BL6. Una mayor confluencia puede alterar el potencial metastásico de las células.
- Agregue 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% por placa, déjelo reposar durante 1 minuto y luego aspire la solución de tripsina-medio.
- Agregue 1 mL de tripsina por placa y devuelva las placas a la incubadora durante 10 min.
- Después de mover las placas de la incubadora a la campana estéril, agregue 4 ml de medio sin suero del Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) a cada placa.
- Recoja las células con una pipeta motorizada estéril. Expulse las células contra la parte inferior de la placa, con la punta presionada en un ángulo muy ligero, para romper las células. Repita varias veces para asegurar una separación adecuada de los grupos de células, que de otro modo podrían obstruir la aguja de expulsión. Recoja y transfiera a un tubo cónico de 50 mL.
- Utilice un hemocitómetro para determinar la densidad celular. Manteniendo constante el número total de células B16-BL6, determine el volumen de RPMI libre de suero necesario para alcanzar concentraciones finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25 y 0,5 millones de células/mL.
- Igualmente, alícuota de los medios en el tubo de 50 mL a tubos cónicos de 15 mL. Centrifugar los tubos cónicos a 2.250 x g durante 5 min. Decantar a los medios de comunicación. Añada un volumen adecuado de RPMI sin suero y confirme la densidad celular deseada a través del hemocitómetro. Ajuste las densidades agregando RPMI adicionales o girando y volviendo a suspender en un volumen más pequeño según corresponda.
- Alícuota 500 μL de cada célula de suspensión en tubos marcados de 1,8 mL sobre hielo.
>2. Inyección de vena de cola
- Compre ratones hembra C57BL/6 (edad de 6 a 8 semanas), 5 ratones por grupo. Espere varios días para que los ratones se adapten.
- Tome un ratón, sostenido por la cola, y guíelo hacia atrás hacia el sujetador de ratones. Con el torso en la cámara principal del sujetador y la cola fuera de él, tire del ratón hacia el extremo del sujetador. Inserte el émbolo de restricción, continuando empujando hasta que el mouse esté seguro.
- Gire el ratón 90 grados de modo que una de las venas laterales de la cola quede hacia arriba. Con una almohadilla con alcohol, limpie vigorosamente el lado de la cola del ratón, particularmente donde la vena de la cola es más visible><.
nota: Una buena iluminación es esencial para una visualización eficaz de las venas de cola en los ratones B57BL/6J. Las lámparas de calor o las almohadillas quirúrgicas térmicas, aunque no son necesarias, también ayudarán a aumentar el volumen de la vena de la cola.
- En una campana de cultivo estéril, recoja 300 μl de medios de cultivo celular del tubo de 2 millones de células/mL. Invierta la aguja, moviendo el costado y empujando el émbolo, para expulsar las burbujas de la jeringa. Expulse el cultivo-RPMI para obtener un volumen final de 250 μL.
- Extienda la cola del ratón con la mano no dominante. Sostenga la cola con el extremo proximal de la cola elevado con el dedo índice de la mano no dominante, y la porción distal de la cola presionada con el pulgar.
nota: De esta manera, la vena de la cola se mantiene en posición lateral, paralela a la superficie de sujeción, con una posible entrada congruente en la parte más distal de la cola.
- Inserte la aguja en la vena de la cola, hacia el extremo distal, en un ángulo descendente de un minuto para empezar, y luego ajuste la aguja para que coincida con el ángulo de la vena de la cola al insertarla más (bajando el extremo del émbolo de la jeringa en relación con la aguja).
- Inserte la aguja aproximadamente 1 cm en la vena de la cola. Después de la inserción, comience a empujar el émbolo, sosteniendo la aguja firmemente.
nota: Si la aguja está en la vena de la cola y el extremo de la aguja no está obstruido, el medio debe fluir sin obstáculos hacia la vena. Una inyección eficaz se caracteriza por la eliminación de la sangre de la vena. Si hay resistencia, o si comienza a formarse una burbuja en el lugar de la inyección, retire la aguja y vuelva a intentarlo en un lugar más proximal a lo largo de la vena de la cola.
- Retire la aguja de la vena y deséchela. Sostenga la gasa contra el sitio de entrada para detener el sangrado.
- Retire el émbolo del retenedor y coloque el ratón en la jaula receptora.
- Repita para todas las demás concentraciones.
nota: El establecimiento de los focos pulmonares tarda aproximadamente 2-3 semanas, con variabilidad en función de la línea celular y del tamaño deseado de los focos. Mientras tanto, los ratones deben ser monitoreados para detectar síntomas que podrían justificar la eutanasia temprana, como el jadeo excesivo.
>3. Contando los focos pulmonares
- Eutanasiar al ratón colocándolo en una cámara de CO2 y exponiéndolo al 100% de CO2 introducido al 10-30% del volumen de la cámara por minuto durante 5 min. A continuación, con la luxación cervical.
- Extiende el ratón sobre la espuma de poliestireno. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión quirúrgica a lo largo del esternón.
- Haz dos incisiones adicionales, ambas desde la parte superior de la incisión del esternón y ramificándose hacia los hombros del ratón, exponiendo la caja torácica.
- Haz dos cortes, cada uno a lo largo de los lados laterales del esternón, para quitar la caja torácica del torso, exponiendo los pulmones y el corazón.
- Sujetando el corazón con pinzas quirúrgicas, corte el esófago y la tráquea, liberando el corazón y los pulmones del ratón. Colóquelo debajo de un microscopio de disección, con un aumento de 10X, para una mejor visualización.
- Disecciona el corazón de los pulmones y extirpa el timo, dejando solo los dos pulmones.
- Con los pulmones debajo de un endoscopio de disección, comience a contar los focos pulmonares. Cada foco debe aparecer como una obtrusión circular de color marrón en la superficie de los pulmones.
- Para mantener la consistencia entre ratones, cuente el número de focos en la superficie de un lóbulo y luego invierta ese lóbulo. Hacer cada uno de los cuatro lóbulos individualmente permite un conteo más fácil.
- Guarde y repare los pulmones si realiza IHQ, de lo contrario, deseche los restos.