HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

Resumen

Fuente: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

En este vídeo, las células infectadas con viriones MCPyV fueron sometidas a una reacción en cadena de hibridación in situ para detectar genomas específicos de MCPyV. Además, la técnica de ADN-HCR se combinó con FISH para visualizar el ADN MCPyV en células de piel humana infectadas.

Protocolo

1. Infección

1. Mantenga los fibroblastos dérmicos humanos primarios en DMEM con 10% de suero fetal de ternero, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina. Al llegar a la confluencia, divida los fibroblastos 1:4 sin girar hacia abajo.
   nota: Para obtener la máxima eficacia de la infección por MCPyV, utilice fibroblastos primarios entre los conductos 5 y 12 que se están dividiendo activamente en el momento de la siembra.
2. Para infectar fibroblastos dérmicos humanos, aspire el medio y lave las células con DPBS.
3. Añadir 1 mL de Tripsina-EDTA al 0,05% a la placa e incubar a 37 °C durante 5-10 min.
4. Revise bajo el microscopio para asegurarse de que las células se desprendan de la placa.
5. Agregue 10 mL de medio DMEM/F12 que contenga 20 ng/mL de EGF, 20 ng/mL de bFGF y 3 μM de CHIR99021, todos los cuales estimulan la infección por MCPyV, a la placa y transfiera la solución celular a un tubo de 15 mL.
6. Gire las celdas a 180 x g durante 2 min y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un medio DMEM/F12 que contenga 20 ng/mL de EGF, 20 ng/mL de bFGF y 3 μM de CHIR99021 a 2-4 x 10⁴ células por mL.
7. Siembre 200 μL de la suspensión celular suplementada con 1 mg/mL de colagenasa tipo IV en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Descongele el stock de viriones MCPyV en hielo. Agregue 10⁹ equivalentes del genoma viral de los viriones MCPyV por 1 μL de yodixanol por cada 2,500 a 5,000 células que se infecten. Golpee suavemente el costado de la placa y colóquela en la incubadora.
8. Después de la incubación a 37 °C en 5% de CO₂ durante 48-72 h, agregue 20% de FBS a cada pocillo.
9. Dejar que la infección proceda a 37 °C en 5% CO₂ durante 72-96 h.

>2. ADN-HCR in situ

1. Fije las células cultivadas en cubreobjetos con 4% de PFA en PBS durante 10 min. Lave los cubreobjetos dos veces con PBS, luego trátelos con etanol al 70% para permeabilizar las células a 4 °C durante la noche.
   nota: Las muestras fijas pueden permanecer en este estado durante varios días.
2. Prehibridación de muestras sustituyendo el etanol por tampón de hibridación con sonda e incubando durante 60 min en RT.
3. Diluir la(s) sonda(s) (1 μM) (Tabla 1) en una solución tampón de hibridación de sonda a una dilución 1:500 30 min antes del final de la etapa de prehibridación e incubar a 45 °C.
4. Al final de las incubaciones, pipetear ~10 μL de la mezcla de sonda diluida por cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Coloque los cubreobjetos, con la célula hacia abajo, en sus respectivas gotas de la mezcla de sondas de hibridación. Selle los bordes y la parte posterior de los cubreobjetos a los portaobjetos con una cantidad generosa de cemento de caucho.
5. Caliente los portaobjetos con sondas añadidas a 94 °C durante 3 minutos colocando los portaobjetos en el lado plano de un bloque térmico. Transfiera los portaobjetos a una cámara humidificada e incube a 45 °C durante la noche. Para hacer una cámara humidificada simple, humedezca ligeramente las toallas de papel estériles con dH₂O y colóquelas en el fondo de un recipiente de plástico que se selle con una junta de goma.
   nota: Durante el calentamiento, el cemento de goma puede burbujear brevemente. Sin embargo, asegúrese de que el sello no se rompa.
6. Retire con cuidado el cemento de goma con pinzas y vuelva a colocar los cubreobjetos con el lado de la celda hacia arriba en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lave los cubreobjetos con tampón de lavado de la sonda a RT tres veces.
7. Incubar el cubreobjetos en el tampón de amplificación (200 μL en placas de 24 pocillos) a RT durante 30-60 min.
8. Mientras tanto, recociendo cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos marcadas reconociendo las sondas (Tabla 1) en tubos de PCR separados calentando a 94 °C durante 90 s y enfriando a RT durante 30 min mientras se protegía de la luz. Mezcle las dos horquillas en un tampón de amplificación, cada una a una dilución de 1:50.
9. Haga una superficie para la reacción de amplificación estirando la película de parafina sobre la cara abierta de una tapa de placa de 24 pocillos. Pipetee 50-100 μL gotas de la mezcla de horquilla/tampón de amplificación en la película de parafina para cada cubreobjetos. Utilice pinzas para retirar con cuidado los cubreobjetos de la solución de preamplificación. Seque el cubreobjetos tocando el borde con una toallita desechable porosa y colóquela con el lado de la celda hacia abajo sobre la gota de amplificación.
10. Coloque la tapa de la placa que sujeta los cubreobjetos en una cámara humidificada e incube durante la noche en RT en la oscuridad.
11. Regrese los cubreobjetos a los pozos una vez más. Incubar las muestras con 5x SSCT [5x cloruro de sodio citrato de sodio (SSC) 0,1% Tween 20 filtrado a través de un filtro de 0,22 μm] que contiene 0,5 μg/mL DAPI durante 1 h en RT. Lave las muestras dos veces con 5x SSCT en RT.
12. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio. Analice las células y obtenga imágenes de las muestras con un microscopio de fluorescencia invertida.

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Tabla 1: Sondas utilizadas en el estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de hibridación de sonda	Tecnologías moleculares
Tampón de lavado de sonda	Tecnologías moleculares
Búfer de amplificación	Tecnologías moleculares
Horquillas etiquetadas con Alexa 594	Tecnologías moleculares	B4	Proteger de la luz
Paraformaldehído	Sigma	P6148