Aislamiento de queratinocitos de piel humana: un método para cultivar queratinocitos primarios a partir de muestras de piel

Resumen

Johansen, C. et al. Generación y cultivo de queratinocitos humanos primarios a partir de piel adulta. J. Vis. Exp. (2017)

Este video describe el aislamiento de queratinocitos, las células más prominentes de la capa epidérmica de la piel humana, mediante el empleo de una combinación de métodos de digestión enzimática y disrupción mecánica. Este método ayuda en el crecimiento preferencial de los queratinocitos sobre otros tipos de células de la piel utilizando un medio de crecimiento selectivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Aislamiento de queratinocitos de la piel humana

1. Comience haciendo las siguientes soluciones: 50 ml de solución de tripsina al 0,25% y glucosa al 0,1% en DPBS. Mezclar y filtrar esterilizar (0,2 μm) la solución. Prepare 10 mL de RPMI-1640 + solución de FBS al 2%, 50 mL de DPBS y medio libre de suero de queratinocitos (KSFM). Añadir suplementos de KSFM y 250 μL de gentamicina a 500 mL de KSFM. Precalentar las soluciones a 37 °C antes de su uso.
2. Recolecta piel de voluntarios adultos sanos que se someten a cirugía plástica. Las muestras de piel utilizadas son de aproximadamente 10 cm x 15 cm, pero pueden variar en tamaño. Mantenga la piel fresca durante el transporte transportando las muestras de piel en una caja de espuma de poliestireno que contenga un elemento de enfriamiento. Si es necesario, la muestra de piel puede almacenarse a 4 °C durante la noche.
3. Retire la grasa de debajo de la sección de piel con tijeras, bisturíes y fórceps esterilizados.
4. Abroche la sección de piel (aproximadamente 10 cm x 15 cm) sobre una cubierta estéril encima de un plato con agujas. Primero, limpie la piel con una gasa seca esterilizada. A continuación, limpie la piel con una gasa esterilizada con etanol al 70%.
5. Con un cepillo de pies, corte la capa superior (epidermis) de la sección de piel y colóquela en una placa de Petri de 9 cm. A continuación, añada inmediatamente 25 ml de la solución de DPBS/tripsina/glucosa (preparada en el paso 1.1) a la placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Con una pipeta, retire la solución de DPBS/tripsina/glucosa de la placa de Petri y agregue 10 mL de RPMI-1640 + 2% de FBS para inactivar la tripsina.
7. Con dos pinzas, libere ahora las células epidérmicas en el medio raspando y agitando suavemente tanto el compartimento epidérmico como el dérmico de las secciones de la piel.
8. Filtre la suspensión de células epidérmicas a través de un filtro metálico (tamaño de orificio de 1 mm) y recoja en un tubo de 50 ml. Agregue las secciones de piel restantes a un tubo de 50 mL que contenga 10 mL de RPMI-1640 sin FBS y vórtice durante 10 s. Filtre la suspensión a través del filtro metálico en un tubo de 50 ml que contiene la suspensión de células epidérmicas. Agregue DPBS a un volumen total de 50 mL.
9. Centrifugar la suspensión de la célula durante 10 min a 450 x g a temperatura ambiente.
10. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células epidérmicas en aproximadamente 10 mL de KSFM a 37 °C, dependiendo del tamaño del pellet de cell. Cuente las células usando el método de tinción de azul de tripano bajo un microscopio. El número de células obtenidas de una sección de piel de 10 cm x 15 cm es de aproximadamente 50-100 x 10⁶ células. A cada matraz de 75^cm2 de cultivo, transfiera 8 x 10⁶ celdas junto con 12 mL de KSFM a 37 °C. Agite suavemente los matraces de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células.
11. Incubar los queratinocitos en una incubadora a 37 °C con 100% de humedad y 5% de CO₂. Cambie el medio después de 2 días y tres veces por semana. Pasan las células cuando el cultivo es 70-80% confluente, lo que tarda aproximadamente 2 semanas dependiendo de la tasa de proliferación de los queratinocitos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Medio de cultivo celular
Suplementos de KSFM	ThermoFisher Scientific	37000-015	Suplementos para KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS sin Calcio y Magnesio
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	Dimetilsulfóxido
Gentamicina	ThermoFisher Scientific	15710-049	Aditivo para medio de cultivo celular
Filtro de esterilización	sartorio	16534	Filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 μm
tripsina	Sigma-Aldrich	T7409	Se utiliza para tripsinizar células
glucosa	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Se utiliza para inactivar la tripsina
fórceps	-	-	Las pinzas de cualquier empresa pueden ser usado
tijeras	-	-	Las tijeras de cualquier empresa pueden ser usado
escalpelo	Swann Morton	0501	Los bisturíes de cualquier empresa pueden ser usado
70% etanol	-	-	-
Almohadillas de gasa	NOBAMED	875420	Las almohadillas de gasa de cualquier proveedor pueden usarse
Cepilladora de pie	Credo Solingen	Año 1510	La cepilladora de pies de cualquier proveedor puede usarse
Placas de Petri	TPP	93100	Las placas de Petri de cualquier proveedor pueden usarse
Filtro metálico	-	-	Tamaño de orificio interno de 1 mm metal filtro
75 cm2 matraces de cultivo	Nunc	156499	-
150 cm2 matraces de cultivo	Ttp	90151	-
Solución de tripsina-EDTA al 0,05%	ThermoFisher Scientific	25300-062	Se utiliza para tripsinizar células cuando Pasaje