Aislamiento de células madre de melanoma: un método para obtener células de melanoma positivas y negativas CD133 mediante la clasificación de células activadas magnéticamente

1. Clasificación magnética de células de melanoma CD133⁺ y CD133^- utilizando columnas LS

1. Prepare un tampón MACS que contenga 2 mM de EDTA y 5% de FCS en PBS. Mezclar por tampón inversor y de filtrado estéril utilizando una unidad de filtro Steritop-GP de 0,22 μm. Enfríe el tampón a 4-8 °C y desgasifique antes de usarlo.
2. Precaliente el medio Accutase, PBS y Quantum 263 a 37 °C.
3. Lave el 80% de las células confluentes con PBS. Agregue una cantidad adecuada de Accutase e incube hasta que las células se desprendan de la superficie de cultivo. Recoja las células en un tubo de 50 ml con el medio Quantum 263.
4. Determine el número de celdas y centrifugue el número requerido de celdas durante 5 minutos a 300 x g y 4-8 °C. (De acuerdo con el protocolo de Miltenyi, se puede cargar un máximo de 2 x 10⁹ celdas por columna LS. Se deben determinar los números óptimos específicos de la línea celular y pueden ser considerablemente más bajos). Aspirar el sobrenadante por completo.
5. Vuelva a suspender un máximo de 1 x 10⁸ células con tampón MACS de 350 μL (para un número de células mayor, amplíe todos los volúmenes siguientes de tampón MACS, reactivo de bloqueo FcR, CD133/1-biotina y MicroBeads anti-biotina en consecuencia).
6. Añadir 100 μL de reactivo bloqueante FcR.
7. Añadir 50 μL de CD133/1-Biotina. Mezclar bien con un vórtice e incubar a 4-8 °C durante 10 min.
8. Lavar las células añadiendo 10 mL de tampón MACS y centrífuga durante 5 min a 300 x g y 4-8 °C. Aspirar completamente el sobrenadante.
9. Repita el paso de lavado (1.8).
10. Resuspender el pellet de célula con tampón MACS de 400 μL.
11. Añadir 100 μL de MicroBeads anti-Biotina. Mezclar bien con un vórtice e incubar a 4-8 °C durante 15 min.
12. Mientras tanto, prepare el separador MACS para la separación magnética. Conecte QuadroMACS al separador MACS Multi Stand. Inserte el número requerido de columnas LS con las alas de la columna hacia adelante en el campo magnético del QuadroMACS. Coloque un filtro de preseparación (con malla de nailon de 30 μm) en cada columna LS y un tubo de recolección apropiado (15 ml o 50 ml) debajo de cada columna. Prepare el filtro y la columna enjuagando con tampón MACS de 3 ml. Deseche el flujo continuo.
13. Lavar las células añadiendo 10 mL de tampón MACS y centrífuga durante 5 min a 300 x g y 4-8 °C. Aspirar completamente el sobrenadante.
14. Vuelva a suspender las células con un tampón MACS de 500 μL y aplique la suspensión de células en la columna LS con el filtro de preseparación.
15. Lavar tres veces con 3 mL de tampón MACS por columna. Agregue el búfer nuevo solo cuando el depósito de la columna esté vacío.
16. El efluente total recolectado contiene la fracción ^de celda CD133 sin etiquetar.
17. Deseche el filtro de preseparación, retire la columna del separador y colóquela en un tubo de recolección adecuado.
18. Aplique 5 mL de tampón MACS. Enjuague inmediatamente las células CD133⁺ etiquetadas empujando firmemente el émbolo en la columna.
19. Para aumentar la pureza de la fracción negativa, aplique la suspensión celular sobre una nueva columna LS equilibrada insertada en el QuadroMACS. El efluente contiene la fracción CD133^-.
20. Deseche las columnas.