Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales de experimentación, reactivos y equipos
- Utilice ratones de la misma edad y sexo. Comience el estudio a las 7-9 semanas de edad porque la piel de la mayoría de los ratones está en telógeno (la fase de reposo) alrededor de esa edad.
- Observe el comportamiento de los animales durante el estudio y si se pelean, lo que suele suceder con los machos, alójelos por separado. Las peleas pueden causar cortes en la piel, que promueven la formación de tumores. Se prefieren los ratones hembra debido a su comportamiento menos agresivo. El tamaño típico del grupo experimental varía entre 8-20 animales por grupo.
nota: Los cálculos de potencia basados en la varianza biológica observada en estudios anteriores ayudan a elegir un tamaño de grupo suficientemente grande. Las cepas utilizadas como ejemplos en este artículo incluyen Balb/c y C57BL/6. Sin embargo, muchas otras cepas de ratones, como SENCAR y FVB, se han utilizado con el modelo DMBA-TPA y ratas Wistar y Sprague-Dawley. Se necesita una licencia del comité nacional o local de trabajo con animales antes del inicio del estudio. Además de las consideraciones generales de bienestar, los criterios de valoración específicos del modelo suelen ser el carcinoma de células escamosas (CCE) y la infección de la piel. Los rasguños en la piel debido a la picazón después de aplicar los productos químicos tumorigénicos en la acetona son típicos, pero por lo demás, los animales no deberían mostrar signos de molestia. Pesarse regularmente (por ejemplo, 2 veces al mes) ayuda a evaluar el bienestar de los animales.
- Use DMBA y TPA, ambos diluidos en acetona. La concentración de trabajo de DMBA es de 250 g/L. Una dosis para un animal es de 50 μg de DMBA en 200 μL de acetona. La concentración de material de TPA es de 125 g/L y la concentración de tratamiento de 25 g/L. Una dosis de TPA para un animal es de 5 μg en 200 μL de acetona.
PRECAUCIÓN: El DMBA es dañino si se ingiere y puede causar cáncer. La acetona se evapora rápidamente y es inflamable. Puede causar mareos e irritar los ojos. Use una máscara de respiración y/o trabaje bajo un flujo de vacío. Cámbiese los guantes después de manipular cualquiera de estos productos químicos. Las jaulas ventiladas individualmente evitan la propagación de los productos químicos durante el alojamiento de los ratones. Después de la aplicación, reúna las puntas de pipeta utilizadas para manipular el DMBA y deséchelas como residuos peligrosos.
nota: El DMBA debe protegerse de la luz. El TPA diluido se almacena a -20 °C, preferiblemente protegido de la luz.
- Procure el siguiente equipo: una báscula, una máquina de afeitar común para el pelaje, pipetas y puntas de un tamaño apropiado, una regla común, una cámara digital, un bloc de notas y un bolígrafo o una computadora para registrar los papilomas, un sistema de anestesia inhalada o un retenedor de ratón con una abertura en la parte posterior y un sistema de narcosis de dióxido de carbono para sacrificar ratones.
>2. Inducción y promoción del papiloma cutáneo
- Afeitar la piel del dorso y pesar al animal. Posteriormente, afeitar la piel siempre que sea necesario, pero no en el momento de la exposición a los productos químicos.
nota: Tenga cuidado al afeitarse alrededor de los papilomas y evite hacer cortes en la piel. Pese cada animal cada 2 semanas para notar cualquier posible pérdida de peso.
- Aplicar 50 μg de DMBA en 200 μL de acetona por vía tópica sobre la zona afeitada con una pipeta 48 h después del afeitado del pelaje. Si es necesario, sujete al animal con anestesia inhalatoria ligera o un protector para ratones.
- Después de 7 días, administre la primera dosis de TPA. Aplicar 5 μg de TPA en 200 μL de acetona por vía tópica con una pipeta 2 veces por semana, preferiblemente lunes y jueves o martes y viernes.
- Cuente, registre y fotografíe los papilomas cada semana. Una masa palpable de más de 1 mm de diámetro se considera papiloma si permanece más de 1 semana. Marque cada papiloma individual en un mapa y anote su tamaño cada semana: guarde fotografías digitales.
