Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Aislamiento de melanocitos y fibroblastos
- Eutanasiar a los cachorros machos y/o hembras C57Bl/6J de 0 a 4 días de edad mediante decapitación, y extirpar las extremidades de los ratones sacrificados con tijeras quirúrgicas.
- En una cabina de flujo laminar, enrolle brevemente la trompa de cada ratón en una placa de Petri estéril que contenga un 70% de etanol. Retire el tronco del etanol y colóquelo en una placa de Petri vacía y estéril.
- Con unas tijeras quirúrgicas, esterilizadas en etanol al 70%, se realiza una incisión en la piel del lado ventral del tronco desde el cuello hasta la cola. Pela la piel de la trompa del ratón con pinzas estériles.
- Coloque la piel, con la dermis hacia abajo, en un plato de 6 pocillos que contenga 3 ml de 1x solución antibiótica/antimicótica e incube a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
- Encienda el picador de pañuelos con los siguientes ajustes: Grosor de la rebanada: 1 μm; Fuerza de la hoja: ~ 60% del máximo; Velocidad: ~50% del máximo.
- Transfiera la piel, con la dermis hacia abajo, a un disco picador de tejido estéril y pase la piel completamente a través del picador de tejido activado 3 veces.
- Transfiera la piel homogeneizada a un tubo cónico estéril de 15 mL que contenga 3 mL de tampón de digestión cutánea (prepare 3 mL de tampón de digestión cutánea fresco que contenga 10% de suero fetal bovino, 1% de solución de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mg/mL de colagenasa tipo I, 0,25% de tripsina porcina y 0,02 mg/mL de desoxirribonucleasa I en RPMI 1640). Mezcle la suspensión resultante pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces con una micropipeta P1000.
- Tapar el tubo cónico e incubar la muestra en un baño de agua a 37 °C durante 15 min, invirtiendo el tubo cada 3-5 min.
- Granular las células de la piel homogeneizadas centrifugando el tubo cónico en un rotor de cubo oscilante a 750 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Con una micropipeta P1000, retire lenta y completamente el tampón de digestión cutánea, teniendo cuidado de no alterar el pellet.
nota: En esta etapa se puede guardar una porción de piel entera y usarla como control para confirmar la pureza celular. Cuele estas células a través de un colador de células de 70 μm y procese continuamente.
- Vuelva a suspender completamente el pellet celular en 1 mL de medio de melanocitos pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15-20 veces con una micropipeta P1000. Agregue la solución celular resultante gota a gota a un pocillo sin recubrimiento de un plato de 6 pocillos que contenga 1 mL de medio de melanocitos.
- Colocar el homogeneizado de piel en placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de CO2. Deje incubar los cultivos durante 40 min.
nota: Durante este tiempo, algunos fibroblastos de la piel se homogeneizarán a la placa sin recubrimiento, mientras que los melanocitos y queratinocitos permanecerán en suspensión.
- Transfiera el sobrenadante de cultivo del plato sin recubrimiento a un pocillo de un plato de 6 pocillos prelavado y recubierto de colágeno. Agregue G418 al medio de modo que la concentración final sea de 100 ng/mL.
- Agregue 2 mL de medios de fibroblastos a un pocillo de la placa sin recubrimiento, que ahora contiene fibroblastos adherentes.
- Incubar ambos cultivos durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de CO2.
- Aspire por separado el medio y cualquier residuo de cada cultivo, 16-24 h después del enchapado. Lave cada plato dos veces con 1 mL de PBS estéril y luego agregue 2 mL de medios de melanocitos frescos más 100 ng/mL de G418 al cultivo de melanocitos y 2 mL de medios de fibroblastos frescos al cultivo de fibroblastos. (Prepare 6 mL de medio de melanocitos frescos que contengan 10% de suero fetal bovino, 7% de suero equino, 1% de solución de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 0,5 mM de di-butiril AMP cíclico (dbcAMP), 20 nM de tetradecanoylforbol 13-acetato (TPA) y 200 pM de toxina del cólera (CT) en Nutrient Mix F-12 Ham's media.
NOTA: Las soluciones madre concentradas de dbcAMP, TPA y CT se pueden fabricar, alícuota y almacenar durante >1 año a -80 °C. Los medios base que carecen de estos componentes pueden almacenarse hasta 1 mes a 4 °C.
Prepare 4 mL de medios de fibroblastos que contengan 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina en el medio Eagle Modificado de Dulbecco. Este medio puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes)
- Después de que los cultivos de melanocitos hayan sido tratados con G418 durante 48 h, lavar las células dos veces con 1 mL de PBS estéril y añadir 2 mL de medios de melanocitos frescos sin G418 al cultivo.
nota: A medida que los fibroblastos en el cultivo de melanocitos continúan muriendo después del tratamiento con G418, lave el plato con PBS estéril para eliminar las células muertas y agregue medios de melanocitos frescos. Los cultivos de melanocitos y fibroblastos deben pasar cuando alcancen el 70-80% de confluencia.
