Preparación del virión del poliomavirus recombinante de células de Merkel (MCPyV): una técnica para producir un virión MCPyV recombinante de alto título

Resumen

Fuente: Wei Liu et al. Infección y detección del poliomavirus de células de Merkel, J. Vis. Exp. (2019)

En este vídeo, mostramos la preparación de viriones de poliomavirus de células de Merkel o MCPyV utilizando células 273TT. Esta tecnología ayuda a producir un alto título de los viriones MCPyV recombinantes.

Protocolo

1. Preparación de virión MCPyV recombinante

1. Digiera 50 μg de plásmido pR17b (portador del genoma MCPyV) con 250 U de BamHI-HF en un volumen de 200 μL (4 h a 37 °C) para separar el genoma viral de la columna vertebral del vector (Figura 1).
2. Añadir 1200 μL de tampón PB (suplementado con 10 μL de NaAc 3 M, pH 5,2) al ADN digerido y purificar en 2 columnas de centrifugado miniprep (20 μg de capacidad de ADN). Eluir el plásmido pR17b digerido de cada columna con 200 μL de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, pH8.0, 1 mM de EDTA).
3. Prepare la reacción de ligadura en un tubo centrífugo de 50 mL. Añadir 400 μL de ADN plasmídico purificado del paso 1.2, 8,6 mL de tampón de ligasa T4 1,05x y 6 μL de ligasa T4 de alta concentración. Incubar a 16 °C durante la noche.
4. Añada 45 mL de tampón PB (suplementado con 10 μL de NaAc 3 M, pH 5,2) a la ligadura y utilice un colector de vacío para cargar a través de 2 columnas de centrifugado miniprep. Eluir cada columna con 50 μL de tampón TE. Espere un rendimiento de aproximadamente 30 μg de ADN.
5. A última hora de la tarde/noche, siembre células 6 x 10⁶ 293TT en una placa de 10 cm que contenga medio DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternero, un 1% de aminoácidos no esenciales y un 1% de L-glutamina sin higromicina B.
6. A la mañana siguiente, asegúrese de que las células tengan aproximadamente un 50% de confluente. Transfectar utilizando 66 μL de reactivo de transfección (1,1 μL/^cm2), 12 μg de ADN R17b aislado de MCPyV religado del paso 1.4, 8,4 μg de plásmido de expresión ST pMtB y 9,6 μg de plásmido de expresión LT pADL.
7. Cuando las células transfectadas estén casi confluentes, al día siguiente, tripsinícelas y transfiéralas a una placa de 15 cm para una expansión continua.
8. Opcionalmente, tome un pequeño número de células 293TT en la expansión y realice la tinción de FI para MCPyV LT (CM2B4) y VP1 (MCV VP1 conejo) para determinar la eficiencia de la transfección. En esta etapa, las señales nucleares de LT pueden ser visibles, pero la expresión de VP1 probablemente no será detectable.
9. Cuando la placa de 15 cm se vuelve casi confluente (generalmente 5-6 días después de la transfección inicial), transfiera las células a tres placas de 15 cm. Recoja las células de los platos de 15 cm cuando estén casi confluentes y siga el protocolo de recolección de virus a continuación.
   nota: Opcionalmente, realice el control de calidad IF como se describe en el paso 1.8. La mayoría de las células deben ser tanto MCPyV LT como VP1 positivas en esta etapa.
10. Para recolectar el virus, tripsinizar las células, centrifugar a 180 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante. Añadir un volumen de pellets de DPBS-Mg (DPBS con 9,5 mM de MgCl₂ y 1x antibiótico-antimicótico). A continuación, añada 25 mM de sulfato de amonio (de una solución madre de pH 9 de 1 M) seguido de Triton X-100 al 0,5 % (de una solución madre al 10 %), 0,1 % de benzonasa y 0,1 % de una DNasa dependiente de ATP. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante la noche.
11. Incubar la mezcla durante 15 minutos en hielo y luego añadir 0,17 de volumen de NaCl 5M. Mezclar e incubar en hielo durante otros 15 minutos. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g en una centrífuga a 4 °C. Si el sobrenadante no es transparente, invierta suavemente el tubo y repita el paso de giro. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
12. Vuelva a suspender el pellet utilizando un volumen de DPBS suplementado con 0,8 M de NaCl y vuelva a centrifugar, como se describe en el paso 1.11.
13. Combine los sobrenadantes de los pasos 1.11 y 1.12, y gire una vez más como se describe en el paso 1.11.
14. Vierta gradientes de yodixanol en tubos de polialómero de pared delgada de 5 mL mediante una capa de base (27 %, luego 33 %, luego 39%) ~ 0,7 ml en pasos de ~ 0,7 mL utilizando una jeringa de 3 mL equipada con una aguja larga o una pipeta p1000.
15. Cargue 3 mL de sobrenadante clarificado que contiene virus en el gradiente de yodixanol preparado.
16. Centrifugado durante 3,5 h a 234.000 x g y 16 °C en un rotor SW55ti. Establezca la aceleración y la desaceleración en lenta.
17. Después de la ultracentrifugación, recoja 12 fracciones en tubos siliconados (cada fracción es de ~ 400 μL).
18. Analizar las fracciones para la presencia de virus mediante reactivo de dsDNA y/o Western blot para VP1 (MCV VP1 conejo). Agrupar fracciones de gradiente con contenido máximo de dsDNA y/o VP1 y caracterizar el stock mediante PCR cuantitativa para calcular el equivalente del genoma viral. Almacene el stock de viriones MCPyV a -80 °C.

Resultados

Figura 1. Producción de virión MCPyV utilizando genoma viral recombinante.(A) Un mapa de plásmidos de pR17b (plásmido del genoma MCPyV). (B) Una imagen representativa de una muestra de virión MCPyV recolectada y purificada a lo largo de un gradiente. La flecha marca la banda de viriones MCPyV concentrados en el núcleo del gradiente. (C) El número de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12 medio	Thermo Fisher Scientific	11330-032
Proteína EGF humana recombinante, CF	Sistemas de investigación y desarrollo	236-EG-200	Almacene a -80 grados centígrados
CHIR99021	Química de las Islas Caimán	13122	Almacene a -80 grados centígrados
CHIR99021	sigma	SML1046	Almacene a -80 grados centígrados
Colagenasa tipo IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispasa II	Roche	4942078001
Antibiótico-Antimicótico	Thermo Fisher Scientific	15240-062	Proteger de la luz
Medio DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965084
Paraformaldehido	sigma	P6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Lote # B2717
MCV VP1 conejo		Suero policlonal de conejo #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm