Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación del tejido transparente de la piel del ratón
NOTA: Todos los ratones utilizados en este estudio tenían un trasfondo genético C57BL/6
- Recolección de tejido de piel de ratón.
- Sacrificar humanamente a los ratones por dislocación cervical.
- Retire con cuidado los pelos de la zona de la piel correspondiente con una recortadora, teniendo cuidado de no herir la piel.
- Lave la piel para descontaminar con etanol al 70% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Levante la piel del cuello dorsal con pinzas y haga una incisión con unas tijeras.
- Disecciona un área grande de la piel dorsal del ratón (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
- Aplanar la piel, con la dermis hacia abajo, sobre un papel de filtro y anotar la orientación anteroposterior de la muestra.
- Recorte el papel de filtro alrededor de la piel diseccionada y colóquelo en un tubo de 15 ml lleno de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparada en PBS.
- Fijar durante 1 hora a temperatura ambiente, o toda la noche en el frigorífico a 4 °C.
- Lave la piel 2 veces 5 min en PBS en un tubo de 15 mL.
nota: Los siguientes (1.1.10 - 1.1.12) son pasos opcionales para el almacenamiento a largo plazo de tejido.
- Deshidratar la piel diseccionada en PBS con una concentración creciente de etanol (25%, 50%, 70%) en un tubo de 15 ml durante pasos de lavado de 1 hora a temperatura ambiente.
- Almacene la piel deshidratada en etanol al 70% en PBS en un tubo de 15 ml a 4 °C hasta su uso posterior.
- Cuatro horas antes del aclarado, rehidrate el tejido de la piel en PBS con una concentración decreciente de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) en un tubo de 15 ml durante pasos de lavado de 1 hora a temperatura ambiente.
- Limpieza de las biopsias de piel de ratón
- Prepare la solución de aclarado CUBIC1 disolviendo 3,85 g de urea y 3,85 g de etilendiamina N,N,N',N'tetrakis (2-hidroxipropil) en 5,38 ml de agua destilada en un calentador ajustado a 60-70 °C. Utilice un agitador caliente.
- Agregue 2,31 g de polietilenglicol mono-p-isooctilfenil éter/Triton X-100 a la solución una vez que esté clara y se haya enfriado a temperatura ambiente.
- Cortar la piel del ratón con una cuchilla de afeitar afilada en biopsias de dimensiones aproximadas de 0,2 x 0,5 cm, y sumergir en 5 mL de solución de limpieza CUBIC1 en un tubo de 15 mL. Para optimizar la visualización de los folículos pilosos, asegúrese de que el lado más largo de la biopsia esté cortado a lo largo de la dirección anteroposterior de la muestra.
- Colocar sobre una plataforma giratoria en un horno de hibridación a 37 °C.
- Cambie la solución de limpieza después de 7 días. Prepare una solución nueva de CUBIC1 antes de usar.
- Comprobar la transparencia del tejido después de 7 días. Si es necesario, deje las biopsias en la solución de aclarado CUBIC1 hasta que el tejido esté completamente transparente.
- Una vez que la biopsia de piel sea transparente, retire la solución CUBIC1 y agregue 4 mL de 1x PBS para lavar el tejido 4 veces durante 6 horas a 37 °C.
- Lavar el tejido cutáneo con sacarosa al 20% p/v en PBS en un tubo de 15 ml durante 4 horas a 37 °C.
- Congele el tejido en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en un tubo de 15 mL durante la noche en un congelador de -80 °C.
nota: Este paso aumentará la permeabilidad de la biopsia para la penetración de anticuerpos en los pasos posteriores.
>2. Tinción de inmunofluorescencia
- Descongele el pañuelo desde (paso 1.2.9) a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.
- Lave el pañuelo en el tubo de 15 ml con 5 ml de PBS durante 8 horas a temperatura ambiente para eliminar el compuesto OCT.
- Transfiera las biopsias a un tubo de 2 mL e incube el tejido en 1 mL de anticuerpo anti-Keratin14 de conejo o anti-Ki67 de conejo, ambos diluidos 1:100 en PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) durante 3 días en un agitador en un horno a 37 °C.
- Transfiera las biopsias a un tubo de 15 mL y lave el tejido 4 veces durante 6 horas en 5 mL de PBST en un agitador en un horno a 37 °C.
- Transfiera las biopsias a un tubo de 2 mL, agregue 1 mL de anticuerpo secundario anti-conejo Alexa594 diluido 1:100 en PBST e incube 3 días en un agitador en un horno a 37 °C.
- Transfiera las biopsias a un tubo de 15 ml y lave el tejido 4 veces durante 6 horas en 5 ml de PBST en un agitador en un horno a 37 °C.
- Transfiera las biopsias a un tubo de 2 mL, agregue 1 mL de solución de contratinción nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:1,000) en PBST e incube durante la noche en un agitador en un horno a 37 °C.
- Retire la solución contramanchante DAPI y agregue 1 mL de PBST al tubo de 2 mL para lavar el pañuelo 4 veces durante 6 horas en un agitador en un horno a 37 °C.
nota: Paso opcional: Las biopsias se pueden almacenar en la oscuridad en 1x PBS con azida de sodio al 0,02% durante al menos 3 semanas.
3. Imágenes
- Prepare la solución de limpieza CUBIC2, que contiene 50% (p/v) de sacarosa, 25% (p/v) de urea, 10% (p/v) de 2,2',2''-nitrilotrietanol y 0,1% (v/v) de Triton X-100.
- Incubar el tejido cutáneo en 1 mL de solución CUBIC2 en un tubo de 2 mL en un agitador durante 24 horas en un horno a 37 °C. Este paso igualará el índice de refracción del tejido.
- Comprueba la claridad del tejido. Una vez que esté transparente, coloque la biopsia de piel completa (0,2 x 0,5 cm) en su lado más largo sobre un cubreobjetos de vidrio, de modo que la dirección de la longitud de los folículos pilosos sea paralela a la superficie del cubreobjetos (# 1 24 x 60 mm).
nota: Paso opcional: Las biopsias teñidas con anticuerpos se pueden almacenar en la solución CUBIC2 durante unos 7 días. Las biopsias teñidas con rojo del Nilo solo se pueden almacenar en la solución CUBIC2 hasta por 1 día y deben tomarse imágenes lo antes posible.
- Prepare la cámara de imágenes (Figura 1).
NOTA: Los consumibles necesarios para la preparación de la cámara de imagen son: tachuela azul, plastilina o similar, y 2 cubreobjetos (24 x 50 mm) (Figura 1A).
- Prepare dos tiras delgadas de tachuela azul (diámetro aproximado de 1 mm x 2 cm) y dos cubreobjetos (Figura 1B).
- Coloque las tiras de tachuelas azules en un cubreobjetos, dejando suficiente espacio para la biopsia de piel (Figura 1C, paso 3.4.3).
- Coloque la biopsia de piel entre las tiras en el cubreobjetos en una gota de solución CUBIC2 (Figura 1C).
- Cubra la biopsia de piel con el segundo cubreobjetos (Figura 1D).
- Coloque la cámara de imágenes con la biopsia de piel montada en la platina de un microscopio confocal y mueva el tejido hacia la vía de luz.
- Escanee la muestra utilizando una fuente de luz de mercurio o halógeno y filtros de epifluorescencia estándar (por ejemplo, DAPI/GFP/CY3/CY5) para identificar las regiones de interés teñidas con fluorescencia.
- Imágenes de regiones de interés utilizando un objetivo 10X y 20X (NA 0,75) y técnicas estándar de imágenes de fluorescencia confocal (por ejemplo, con muestras teñidas con DAPI se iluminan con un láser de 405 nm y recogen la señal de fluorescencia entre 425-475 nm, y con Alexa Fluor 594 o las muestras teñidas con rojo del Nilo se iluminan con un láser de 561 nm y recogen la señal de fluorescencia entre 570-620 nm).
- Genere pilas Z de imágenes de cada región de interés utilizando el software de adquisición de imágenes Z-stack de microscopio (por ejemplo, utilizando el software de adquisición de imágenes NIS elements 4.13 como se describe a continuación).
- Garantice una potencia láser óptima y seleccione los ajustes PMT HV/Offset para recoger la fluorescencia de la muestra.
- Abra la barra de herramientas "Adquisición ND" desde "Controles de adquisición".
- Seleccione la pestaña "Configuración de la serie Z" (asegúrese de que todas las demás pestañas no estén seleccionadas).
- Durante el escaneo en vivo, concéntrese en la parte superior de la muestra y presione el botón "Superior".
- Concéntrese en la parte inferior de la muestra y presione el botón "Inferior".
- Ingrese el tamaño de paso requerido (o presione el botón de tamaño de paso optimizado).
- Presione el botón "Ejecutar ahora".
- Guarde las pilas Z resultantes como pilas de imágenes Tiff individuales (1 fluorocromo por pila Z de imagen).
- Utilice las pilas Z de imágenes para reconstruir las regiones de interés del volumen 3D utilizando software de análisis 3D (por ejemplo, utilizando Imaris x64 7.2.3 como se describe a continuación).
- Inicie el software de análisis.
- Elija el botón "Sobrepasar" en la barra de herramientas para la generación de volúmenes 3D.
- Abra la pila Z de la imagen en primer color (por ejemplo, DAPI).
- Utilice la herramienta 'agregar canal' para agregar canales de color adicionales, un canal por fluorocromo. Por lo tanto, una muestra que contenga fluorocromos DAPI y Alexa Fluor 594 requerirá dos canales.
- Utilice la herramienta "Propiedades de la imagen" para establecer las dimensiones correctas de píxeles (vóxel) (XYZ), como se determina en el punto 3.7 anterior.
- Utilice la herramienta "Ajuste de pantalla" para cambiar los colores de los canales según sea necesario (por ejemplo, configure el canal DAPI en azul, el canal Alexa Fluor 594 en rojo).
- Para colocar el volumen 3D en la ventana de la imagen, utilice el ratón del ordenador para hacer clic y arrastrar el volumen según sea necesario.
- Utilice la herramienta "Instantánea" de la barra de herramientas para generar capturas de pantalla de la imagen 3D.
- Utilice la herramienta "Animación" en la barra de herramientas para generar películas de rotación de muestras 3D.
