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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Modificación genética de queratinocitos humanos primarios
NOTA: Utilice células fénix anfotrópicas cultivadas en medios DMEM completos [DMEM + 10% de suero fetal bovino (FBS) + pluma/estreptococo] para producir virus que infecten los queratinocitos humanos primarios. Los genes de empaquetamiento viral que codifican proteínas como gag-pol y envelope se integran de manera estable en el genoma de la célula fénix, lo que permite la producción del virus cuando se transfecta con un vector retroviral. Las células Phoenix se pueden transfectar con alta eficiencia, lo que permite una alta producción de títulos virales. Los virus producidos en esta línea de envasado también pueden infectar una gran variedad de células de mamíferos, incluidos los humanos.
- Día 1: El día antes de la transfección, siembre las células fénix en una placa de 6 pocillos a una densidad de 800.000 células por pocillo en medios DMEM completos.
- Día 2: El día de la transfección, use 3 μg de vectores retrovirales por pocillo. Alícuota 3 μg de vector retroviral en un tubo de 1,5 mL. Utilice una mezcla de 100 μL de DMEM más 6 μL de reactivo de transfección por cada 3 μg de vector. Mezclar 6 μL de reactivo de transfección con 100 μL de DMEM en un tubo de 1,5 mL. (Los vectores retrovirales que se utilizan se enumeran en la tabla de equipos/materiales)
- Incubar durante 5 minutos y añadir la mezcla de 106 μL en el tubo prealícuota que contiene 3 μg de vector retroviral. Mezclar e incubar a RT durante 30 min. Agregue toda esta mezcla gota a gota a cada pocillo de las células fénix.
- Día 3: Al día siguiente de la transfección, retire el medio de las células fénix y agregue 2 mL de medio DMEM completo y fresco. El mismo día, siembre los queratinocitos humanos primarios en placas de 6 pocillos a una densidad de 75.000 células por pocillo. Mantener los queratinocitos en un medio libre de suero de queratinocitos (KCSFM) con antibióticos (pen/estreptococo).
nota: Se compraron queratinocitos humanos primarios. Las celdas se pueden comprar a una variedad de proveedores (enumerados en la tabla Materiales).
- Día 4: Recolecta los medios de las células fénix transfectadas, que ahora contienen partículas virales. Pase el medio a través de un filtro de 0,45 μm con una jeringa (para eliminar cualquier célula fénix contaminante) y coloque 2 mL sobre los queratinocitos (sembrados a 75.000 células/pocillo el día anterior). Agregue bromuro de hexadimetrina (5 μg/mL) al medio para ayudar a mediar el proceso de infección. Los títulos virales son ~1 x 107 TU/mL.
- Gire las placas de 6 pocillos en una centrífuga a 200 x g durante 1 hora en RT. Después del centrifugado, retire el medio que contiene el virus y lave las celdas una vez con 1x PBS antes de agregar KCSFM.
- Día 5: Infectar de nuevo el mismo lote de queratinocitos que en 1.4, utilizando 2 mL de medio filtrado que contiene bromuro de hexadimetrina (5 μg/mL). Gírelo a 200 x g durante 1 hora en RT para eliminar los medios que contienen virus y lávelo con 1x PBS, luego agregue KCSFM.
nota: Seleccione los queratinocitos utilizando un fármaco si hay un marcador seleccionable en el vector retroviral y amplíelos para su uso en análisis posteriores o aplicaciones como cultivos organotípicos.