Ensayo de formación de colonias de queratinocitos: un ensayo in vitro para evaluar la capacidad de los queratinocitos para convertirse en colonias

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Recolección y siembra de queratinocitos primarios

1. Eutanasiar de cuatro a cinco ratones hembra adultos a través de la inhalación de CO₂ de acuerdo con los estándares aprobados de las instalaciones para animales/IACUC. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para ratones hembra/macho individuales.
   1. Corta aproximadamente 9^cm2 del pelaje dorsal con una maquinilla eléctrica y coloca todos los ratones recortados en un frasco de 500 mL con suficiente solución antiséptica de povidona yodada (no exfoliante) para cubrirlos durante 1-2 min. Agita bien el frasco para cubrir la solución antiséptica sobre los ratones de manera uniforme.
   2. Vierta la solución y enjuague con agua limpia hasta que el líquido salga claro. Repita el mismo lavado antiséptico seguido de un enjuague con agua. Después del lavado antiséptico con solución de yodo, remoje todos los ratones en etanol al 70% durante 5-10 min.
      NOTA: Los ratones con pelaje claro (por ejemplo, BALB/c) conservarán un ligero color amarillento debido a los lavados con yodo antiséptico, mientras que los ratones más oscuros (por ejemplo, C57BL/6) no lo harán. En particular, la viabilidad celular o el crecimiento del cultivo no se ven afectados debido al color amarillo.
2. Retire con cuidado la piel dorsal recortada con pinzas para el pulgar y tijeras en una capucha de flujo laminar. Coloque la piel dorsal extirpada en un tubo cónico lleno de gentamicina PBS/2x. Evite el uso de la piel del lado ventral para prevenir la contaminación de las células mamarias en el cultivo.
3. Usando pinzas esterilizadas en autoclave y un bisturí, coloque una piel dorsal a la vez, con el lado velloso hacia abajo, sobre una placa de Petri delgada. Comience a raspar todo el tejido subcutáneo, incluida la grasa del lado ventral del tejido de la piel, hasta que esté semitranslúcido. Trate de eliminar el máximo de rastros de tejido subcutáneo sin desgarrar la piel (parte del folículo piloso). Además, no raspe durante mucho tiempo y evite secar la piel.
   1. Mantenga la piel raspada en una solución de PBS hasta que se procesen todas las demás pieles restantes. Luego, con un bisturí, corte las pieles en tiras de 0,5 cm x 1-1,5 cm y coloque el lado peludo hacia arriba en una placa de Petri estéril.
4. Pipetear cuidadosamente 20 mL de solución de PBS/2x gentamicina mezclada con tripsina (0,25%) en una placa de Petri de plástico de 100 mm x 20 mm. Con pinzas estériles, transfiera las pieles y hágalas flotar con el lado velloso hacia arriba sobre la superficie de la solución de tripsina durante 2 h en una incubadora a 32 °C.
   NOTA: El tiempo y la temperatura de tripsinización son cruciales para un buen rendimiento de queratinocitos primarios altamente cultivables. Aunque otros métodos pueden proporcionar buenos rendimientos de células viables, la cultivabilidad de los queratinocitos ha sido menos satisfactoria.
   1. Durante este tiempo de incubación de 2 h, cubra los platos con una capa de colágeno y colóquelos a 37 °C durante 1 h (consulte el paso 1.1.2). Para los ensayos clonogénicos, las placas de Petri de 60 mm se recubren 24 horas antes de la recolección de queratinocitos para permitir que la capa alimentadora 3T3 irradiada se adhiera al fondo y se extienda uniformemente
      nota: El recubrimiento de las placas de cultivo para el cultivo clonogénico es muy importante para la unión adecuada, la formación de colonias y el crecimiento/proliferación final de los queratinocitos epidérmicos de ratones.
5. Paso de raspado epidérmico: Coloque una placa de Petri cuadrada de plástico estéril y cree una superficie con una inclinación de 30° para un raspado epidérmico adecuado con 15 mL de medio de recolección (ver Tabla 1). Retire con cuidado una tira de piel flotante de la solución de tripsina con pinzas curvas. Luego, con una nueva hoja de bisturí, raspe la epidermis y los pelos en el medio.
   1. No use fuerza excesiva, pero use la fuerza suficiente para raspar la epidermis o afectar la viabilidad celular.
   2. Durante el raspado de la epidermis, mantenga la cuchilla perpendicular a la pieza de piel. Si la cuchilla está inclinada hacia el movimiento de la cuchilla, hay más posibilidades de que la piel se desgarre. Si la cuchilla está inclinada en dirección opuesta al movimiento de la cuchilla, hay más posibilidades de que la epidermis se extirpe incompletamente.
6. Vierta con cuidado el medio de recolección que contiene células epidérmicas raspadas en un frasco estéril de 60 ml (esterilizable en autoclave y reutilizable) con una barra magnética para agitar de 1.5 pulgadas. Enjuague la placa de Petri con un medio de recolección adicional para recolectar las células epidérmicas restantes y llevar el volumen final a 30 mL. Utilice un agitador magnético y revuelva a 100 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este proceso eliminará las células epidérmicas atrapadas de los cabellos.
7. Coloque un filtro de células estéril de 70 μm en la parte superior de un tubo cónico de 50 mL. El filtro de células encaja en la parte superior de un tubo cónico de 50 mL.
   1. Lleve el frasco dentro de una capucha de bioseguridad. Retire la barra agitadora y vierta el contenido en el filtro colador conectado a un tubo cónico de 50 mL. Cuela el cabello no deseado y las láminas del estrato córneo.
   2. Presione los pelos junto con los materiales del estrato córneo dentro del colador y manipúlelos para liberar las células ciliadas atrapadas. Use 5 ml de medio de recolección para permitir que las células atrapadas restantes se liberen y fluyan hacia el tubo. Lleve el volumen total hasta 50 mL en un tubo cónico.
8. Tapar el tubo cónico de 50 ml con filtrado de celda y centrífuga a 160 x g durante 7 min a 4 °C. A continuación, aspire el sobrenadante y añada 5 mL de medio de recolección. Finalmente, vuelva a suspender el pellet de celda triturando suavemente ~ 20x con una pipeta de 5 mL.
   1. En este paso, mantenga las celdas en una nevera para evitar cualquier agregación. A continuación, añadir 25 mL de medio de recolección y triturar de nuevo (20-25x).
   2. Para asegurar un recuento preciso de queratinocitos en este paso, tome 1 mL de suspensión celular y agregue 19 mL de medio de recolección. Ahora, la dilución celular es 1:20 en un tubo cónico de 50 mL. Si los queratinocitos se recolectan de un solo ratón, ajuste el volumen de la suspensión celular. Por ejemplo, en lugar de 30 mL, use 15 mL y haga una dilución 1:10 para contar las células.
9. Pipetear 0,5 mL de células diluidas del tubo cónico de 50 mL (dilución 1:20) y transferir a un tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave de 1,5 mL. Retire 0,2 ml (200 μL) de la mezcla celular y colóquela en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada un volumen igual (200 μl) de solución de azul de tripano al 0,4 %. Mezcle suavemente esta solución 3 veces y transfiera las células a un hemocitómetro para contar los queratinocitos nucleados.
   1. Marque todas las células azul oscuro positivas para azul tripano como células muertas no viables, y marque las células pequeñas doradas y rosadas como células viables. Por lo tanto, el rendimiento final de queratinocitos por ratón debería ser de alrededor de 30 millones de células viables.
10. Centrifugar el tubo cónico original de 50 ml (a partir del paso 1.8) durante 7 min a 160 x g a 4 °C. En este paso, vuelva a suspender las células en el medio deseado y haga la dilución necesaria para sembrar las células.
    1. Para el cultivo masivo, siembre de 2 a 4 millones de células de oro viables en cada placa de Petri de 35 mm en un medio de cultivo celular (medio tipo KGM + suplementos para cultivos monocapa) (ver Tabla 1). Para un ensayo clonogénico (formación de colonias), se sembraron 1.000 células por placa de Petri de 60 mm en capas alimentadoras de ratón suizo 3T3 irradiadas con rayos X con recubrimiento de colágeno y medio Willia's E modificado con suplementos y suero.
    2. Utilice un total de 2 a 4 ml de medio para placas de Petri de 35 mm y 60 mm, respectivamente. Además, formule el medio DMEM y Williams E obtenido de ATCC con niveles reducidos de bicarbonato de sodio para su uso al 5% de CO₂.
11. Cultivar las células de cultivo (masivas o clonogénicas) a 32 °C, 95% de humedad con 5% de CO₂. Cambie los medios un día después de la siembra inicial para la cultura de masas, y luego 3 veces por semana a partir de entonces. Sin embargo, para los ensayos clonales, el primer cambio de medio es 2 días después de la siembra de células y 3 veces por semana a partir de entonces.
12. Para el cultivo clonal, cultive células a intervalos de dos y cuatro semanas. Después de completar los cultivos clonales (2 o 4 semanas), aspirar el medio. Fijar las colonias en formol tamponado al 10% durante la noche a temperatura ambiente y teñir con rodamina B al 0,5% en agua de autoclave durante 1 h. A continuación, retira la mancha de rodamina B con una pipeta desde el borde de los platos.
    1. Enjuague los platos con agua fría esterilizada en autoclave hasta que los platos se aclaren. Coloque los platos inclinados en la tapa de los platos y déjelos secar para el recuento final de la colonia. En particular, al realizar un ensayo de cultivo clonogénico, nunca pipete <1 mL de células. Si las células están concentradas, diluya en serie la concentración de células.

Tabla 1: Recetas de soluciones y medios.