Transgénesis basada en vectores miniCoopR: una técnica para detectar genes inductores de melanoma en un modelo de tumor de pez cebra

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Detección de modificadores de inicio de melanoma

1. Cree clones de entrada intermedia Gateway por PCR, amplificando el marco de lectura abierto de longitud completa de los genes de interés (GOI) y recombinándolos en pDONR 221 utilizando la clonasa BP II (Invitrogen). Utilice la tecnología Multisite Gateway (Invitrogen) para recombinar p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA y miniCoopR para colocar genes de interés bajo el promotor mitfa en el vector miniCoopR (Figura 1A).
2. Inyecte 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos de ARNm de la transposasa Tol2 en Tg de una célula(mitfa:BRAFV600E); P53(LF); Embriones de pez cebra triplemente homocigotos como se describió anteriormente. Incubar los embriones inyectados a 28,5 °C. Extraer los embriones muertos a 24 hpf.
3. Seleccione animales transgénicos con melanocitos rescatados a 72 hpf colocando la placa de Petri que contiene los embriones inyectados en un microscopio de disección bajo luz incidente sobre un fondo blanco (Figura 1A).
4. Transfiera los animales a tanques de 3 L en el vivero de la instalación de pez cebra a 4 dpf.
5. A los 2 meses, seleccionar los animales con al menos un área de rescate de melanocitos mayor de 4^mm2 (Figura 1A). Existe una fuerte correlación entre el grado de rescate de melanocitos a los 72 hpf y el grado de rescate de melanocitos a los 2 meses. Cuando los embriones con rescate de melanocitos se seleccionan a 72 hpf, la mayoría de ellos (~80%) tendrán al menos un área de rescate de melanocitos mayor de 4^mm2 a los 2 meses.
6. Examinar semanalmente a los animales seleccionados para detectar la presencia de tumores (Figura 1B). Existe una fuerte correlación entre los cambios histopatológicos y morfológicos. La transición de benigno a maligno se reconoce como un cambio morfológico cuando las lesiones se elevan de la superficie del animal. Aislar animales portadores de tumores para su estudio.
7. Traza curvas de supervivencia libre de melanoma con la edad en semanas en la abscisa y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Los animales con melanocitos que expresan un gen de interés se comparan con los animales de control que expresan EGFP (proteína verde fluorescente mejorada) en los melanocitos (Figura 1C). La mediana de aparición del tumor en los animales inyectados con miniCoopR-EGFP es de aproximadamente 18 semanas. Determine si las dos curvas son estadísticamente diferentes utilizando una prueba de rango logarítmico.

Figura 1. Cribado de modificadores de la aparición del melanoma mediante el ensayo miniCoopR. A) Esquema del ensayo miniCoopR. Embrión con melanocitos rescatados (punta de flecha) que contienen el vector miniCoopR y el gen de interés. Barra de escala = 250 μM. Adulto con rescate de melanocitos mayores de4 mm2 (punta de flecha). Barra de escala = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP rescató a un pez cebra con un tumor amelanótico y otro pigmentado (puntas de flecha). C) Curva representativa de supervivencia libre de melanoma comparando tumores que expresan el oncogén SETDB1 y un gen EGFP control (p = 9,4×10-7, rango logarítmico χ2).