Tinción de anticuerpos de melanocitos de escamas: una técnica para detectar factores de transcripción expresados en melanocitos asociados a escamas dorsales de modelos de pez cebra

En este artículo

Resumen

Fuente: Sharanya Iyengar et al. Cribado de modificadores de melanoma utilizando un modelo de tumor autóctono de pez cebra. J. Vis. Exp. (2012)

Este video describe el método de tinción de anticuerpos para detectar la expresión de factores de transcripción en melanocitos asociados a la escama dorsal de modelos de pez cebra. Esta técnica de inmunotinción ayuda a identificar específicamente el factor de transfección A inductor de melanocitos en el pez cebra transgénico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Tinción de anticuerpos de melanocitos a escala

Prepare el tampón PO₄ con 80 mL 0.1M Na₂HPO₄ y 20 mL 0.1M NaH₂PO₄. Asegúrate de que el pH sea de 7,3. Prepare 2x tampón fijo que contiene 8,0 g de sacarosa, 0,15 mL 0,2M CaCl₂ y 90 mL 0,2M TPH_{PO 4}, pH 7,3. Si es necesario, ajuste el pH a 7,3 con NaOH o HCl, luego haga hasta 100 ml con tampón PO₄.
Pesar hasta 300 mg de PFA sólido y añadirlo a un tubo de microcentrífuga. Añadir 5 mM de NaOH a un volumen igual a 4,5 x masa, en mg, de PFA (por ejemplo, 450 ul 5 mM de NaOH a 100 mg de PFA). Calentar a 60-70 °C con agitar ocasionalmente hasta que se disuelva el PFA. Centrifugar las partículas restantes y recuperar un 20% de sobrenadante de PFA. Hazlo fresco cada vez.
Prepare la solución de fijación que contenga 1x tampón de fijación y 4% de PFA.
Anestesiar al pez en 0,17 mg/mL de tricaína.
Usando luz incidente bajo un microscopio de disección, arranque las escamas dorsales con pinzas afiladas de punta fina, teniendo cuidado de no dañar la mitad de la escama que contiene melanocitos (Figura 1A). Coloque las básculas directamente de las pinzas en la solución de fijación de 1 ml e incube a temperatura ambiente, mientras gira, durante ≥ 2 horas. Transfiera los peces al agua de los peces y monitoree a los peces para confirmar la recuperación exitosa.
Para blanquear los melanocitos pigmentados, lavar las escamas fijas en PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 veces durante 5 min a temperatura ambiente. Agregue 1 ml de solución de lejía recién hecha que contenga 0,4 mL 10% KOH y 0,15 mL 30% H₂O₂ en 5 mL con dH₂O. Coloque parafilm o cierres de tapa para evitar que el gas abra los tubos. Continúe blanqueando hasta que el pigmento desaparezca (10 minutos es lo típico) (Figura 1B, C). Lavar en PBST cuatro veces durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Bloquee durante al menos 30 min en una solución en bloque compuesta por 1x PBS pH 7.4, 0.2% Triton X-100, 2 mg/mL BSA, 1% DMSO, 0.02% NaN₃ y 2% suero de cordero. Omita el NaN₃ si se desarrolla con reacción HRP.
Incubar con el anticuerpo primario en solución en bloque durante la noche a temperatura ambiente. Debe tener al menos 400 μL de solución sobre las muestras para mantenerlas sumergidas.
Lave las básculas 3 veces durante 30 minutos en PBST a temperatura ambiente.
Incubar con anticuerpo secundario desde 2 horas hasta toda la noche en solución en bloque a temperatura ambiente.
Teñir durante 10 min con PBST + 0,1 μM DAPI.
Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBST.
Monta las escamas en un portaobjetos de vidrio en una gota de vectashield de modo que el lado cóncavo de las escamas mire hacia abajo hacia el portaobjetos y coloca una cubierta de vidrio sobre ellas. Selle los bordes del portaobjetos con esmalte de uñas transparente y observe los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1D, E, F, G).

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Resultados

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Figura 1. Tinción de anticuerpos de melanocitos escamosos. A) Escamas extraídas de un pez cebra miniCoopR-EGFP anestesiado. B) Escama sin blanquear con melanocitos pigmentados y C) escama blanqueada de pez cebra miniCoopR-EGFP. Barra de escala = 100 μM. Incrustación sin blanquear teñida con un D) anticuerpo Mitfa y...