Ensayo de trasplante subcutáneo: un método para trasplantar células de melanoma de un donante a un modelo de pez cebra receptor

Resumen

Fuente: Iyengar, S. et al. Cribado de modificadores de melanoma utilizando un modelo de tumor autóctono de pez cebra. J. Vis. Exp.(2012)

Este video describe el método para el trasplante de células tumorales del modelo de pez cebra donante portador de melanoma a un receptor inmunodeprimido, el pez cebra Casper. Ayuda a visualizar el injerto tumoral y la proliferación en el pez receptor.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ensayo de trasplante

1. Prepare el pez Casper receptor de 2-3 meses de edad irradiándolo con 25 Gy de irradiación gamma un día antes del trasplante. Permita que los peces se recuperen en el agua de los peces.
2. Sacrificar a un pez portador de tumores de acuerdo con las directrices institucionales. En concreto, se coloca un pez en un plato con 0,6 mg/mL de tricaína hasta que se detiene el movimiento de las branquias.
3. Corte el tumor y colóquelo en una placa de Petri con un filtro de aproximadamente 5 mL, esterilizado con 0.9x PBS con 5% de FBS. Corta el tumor en dados con una navaja mientras está en solución.
4. Trabajando a temperatura ambiente, triture con una pipeta P1000 para obtener celdas individuales. Aumente el volumen a 25 mL con filtro esterilizado 0.9x PBS con 5% de FBS.
5. Filtre a través de un filtro de malla de 40 μM.
6. Gire en una centrífuga de mesa Eppendorf 5810R a 1.500 rpm (453 rcf) durante 10 min.
7. Retire el sobrenadante y haga la suspensión celular hasta la concentración aproximada deseada (suponga 10^{a 7} células para un tumor de 100^mm3).
8. Calcule el número exacto de células con un hemocitómetro y diluya la suspensión celular de modo que el volumen final de la inyección sea de aproximadamente 5 μL. Por ejemplo, si se van a inyectar 50.000 células, la suspensión celular debe diluirse hasta una concentración final de 10.000 células/μL. Agite el tubo que contiene la suspensión celular cada pocos minutos para evitar la aglomeración de las células.
9. Lave una jeringa Hamilton 701 N de 10 μL calibre 26s (punta biselada) 2-3 veces con etanol al 100% y PBS 0,9x. Cargue la jeringa con 5 μL de la suspensión celular.
10. Anestesiar al pez receptor irradiado con 0,17 mg/mL de tricaína. Coloque el pescado de costado sobre una toallita Kimwipe húmeda (Figura 1A).
11. Estabilice el pez con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45° en el flanco del pez por encima de la cavidad peritoneal, aproximadamente a mitad de camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde anterior de la aleta dorsal.
12. Permita que los peces se recuperen en agua dulce y observe a los peces diariamente para ver si hay injerto tumoral (Figura 1C). Si se ha producido un injerto, también se puede observar un crecimiento continuo y el desarrollo de la enfermedad.

Resultados

Figura 1. Trasplante de células de melanoma. A) Pez cebra Casper no inyectado. Barra de escala = 500 μM. B) Sitio de trasplante subcutáneo (punta de flecha) en un receptor de Casper irradiado inmediatamente después de la inyección con 50.000 células de melanoma. Barra de escala = 200 μM. C) Receptor de Casper

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos de recombinación de puerta de enlace	Invitrogen
miniCoopR
pez cebra casper
Jeringa 701N de 10 μl	Hamilton/Fisher	14-824
Filtro de 40 μM	BD Halcón/Pescador	352340
FBS	Invitrogen	26140079