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1. Preparación de medios y reactivos
- Preparación de 200x de caldo de ácido L-ascórbico 2-fosfato
- Disuelva 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 mL de solución de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco y filtre a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Almacenar como alícuotas estériles de 0,25 mL a -20 °C.
- Añadir 0,25 mL de alícuota de 200x ácido L-ascórbico 2-fosfato por cada 50 mL de medio fibroblasto (DMEM con 1% de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino) el día requerido, para una concentración final de 0,1 mM de ácido L-ascórbico 2-fosfato.
- Preparación de medios de crecimiento de queratinocitos
- Previamente se ha descrito el aislamiento y cultivo de queratinocitos de carcinoma primario de células escamosas (CCE). La preparación de los medios de crecimiento de queratinocitos también se describe en él.
- Brevemente, prepare los medios de la siguiente manera:
300 mL de DMEM y 100 mL de F-12 de Ham suplementados con 10% FBS
0,4 mg/mL hidrocortisona
5 mg/mL de insulina
10 ng/mL EGF
5 mg/mL transferrina
8,4 ng/mL de toxina del cólera
13 ng/mL de liotirironina
1x solución de penicilina-estreptomicina
>2. Construcción in vitro de matriz nativa derivada de fibroblastos en medios suplementados con ácido L-ascórbico 2-fosfato
- Siembre 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de 6 pocillos (20.000 células/cm2) en medios de fibroblastos suplementados con ácido L-ascórbico 2-fosfato. Vuelva a alimentar cada 2-3 días con 2-5 mL de medio. (Nota: La frecuencia y el volumen de realimentación se pueden ajustar para adaptarse a las necesidades individuales de las diferentes celdas).
- Al cabo de las 6 semanas se formará una gruesa capa de células incrustadas en la matriz extracelular, visible a simple vista (Figura 1). Para liberar esta capa de la placa de cultivo de tejidos, raspe suavemente la circunferencia de la matriz con una punta de micropipeta de 1 mL y luego empuje los bordes de la matriz hacia el centro del pocillo. Esta capa de células y matriz (matriz nativa) debería ser fácilmente desmontable de la superficie de la placa, y ahora estar flotando en el medio. Extienda la matriz nativa en el medio para evitar que se pliegue sobre sí misma.
- Deje que la matriz nativa flote y se remodele durante 5 días, cambiando de medio cada 2-3 días. Debido a la resistencia a la tracción y la remodelación intrínseca dentro de la matriz, la matriz se contraerá drásticamente y se reducirá a una matriz nativa más pequeña, pero más gruesa, lista para ser utilizada para el ensayo de invasión.
>3. Ensayo de invasión con queratinocitos SCC tumorales
- Recoja la matriz nativa suavemente con pinzas romas y transfiérala a una red de nylon. Una vez en la red de nylon, extienda la matriz suavemente hasta quedar lo más plana posible con una punta de micropipeta de 1 ml y pinzas romas.
- Prepare los cilindros clonales estériles untando una pequeña cantidad de vaselina estéril en un extremo.
- Coloque los cilindros clonales en la matriz nativa, con el lado de la vaselina hacia abajo. Esto es para asegurar un sellado hermético entre la matriz nativa y los anillos clonales.
- Añada células cSCC a los cilindros clonales (250.000 células en 100 μl de medio de crecimiento de queratinocitos).
- Retire los cilindros clonales después de 6 horas cuando las células cSCC se hayan asentado en la matriz nativa.
- Levante la red de nailon con la matriz nativa y las celdas cSCC a la interfaz aire-líquido sobre el soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado.
- Agregue el medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con ácido ascórbico hasta que el nivel del medio toque el fondo de la matriz nativa.
- Cambie la media cada 2-3 días y coseche a los 7 y 14 días, después de la siembra de las células cSCC.
