Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.
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Artículo de método
Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras
Protocolo
Preparar los reactivos
Nota: Todas las PBS contiene Ca 2 + y Mg 2 +
- Detección de los reactivos
Añadir 20μM 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensión de células se requieren reactivos de detección de 2 ml. - Paraformaldehído al 1% (células fijas)
Diluir al 4% de paraformaldehído en solución de reserva temperatura ambiente PBS. Alícuota de 1 ml de paraformaldehído al 1% a cada tubo FACS. Tres tubos de FACS se requieren para cada condición experimental (por ejemplo, 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necesi....
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Discusión
La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 3. Estos resultados sugieren que la calpaína-2 la activi.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la leucemia y el linfoma de la Sociedad de Canadá y la Fundación Linfoma de Canadá.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehído | Invitrogen | Disuelva 4 g de paraformaldehído en 100 mL de PBS. En cabina de flujo laminar, caliente la muestra con agitación hasta que quede transparente. Deje enfriar y luego almacene a 4°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Utilice PD150606 recién reconstituido para lograr una inhibición máxima de la calpaína. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow más perlas fluorescentes, tubos FACS | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | El sobrenadante de células WEHI-3 se utiliza como fuente de IL-3 en estos experimentos. Cada colección de sobrenadante de WEHI-3 se titula para determinar la concentración óptima empleada para el crecimiento de células 32Dkit. |
Referencias
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
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Reimpresiones y permisos
