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- Hacen que las agujas de vidrio antes de la cirugía del ratón:
- Coloque el tubo capilar de vidrio en un extractor de micropipeta.
- Calentar la mitad del tubo de vidrio para suavizar el tubo de vidrio en el área localizada.
- Estire el tubo de vidrio a lo largo de su eje longitudinal por una distancia inicial suficiente para causar una reducción en el diámetro del tubo de vidrio en el área localizada.
- Mantenga el estiramiento del tubo de vidrio hasta que se rompe. De esta manera, dos agujas idénticas barril se obtienen.
- Coloque la aguja de vidrio en un microforge. Un ángulo de 30 ° es suficiente para bisel de la punta.
- Compruebe con el microscopio que cada aguja tiene el diámetro interior correcto. Para la mayoría de los fármacos hidrófilos un diámetro de 30-50 micras interior es ideal (figura 1).
- Llene la aguja con aceite mineral de la más amplia extremo de la aguja de vidrio. Deje que el aceite mineral (MSDS, cat. M7700) entra por capilaridad hasta que llega a aproximadamente el 50% de la longitud del tubo capilar. Ponga la grasa de alto vacío (Dow Corning, cat. 05054-AB) alrededor del pistón para sellar el extremo más ancho de la aguja.
- Inserte el émbolo por el extremo más ancho de la aguja y presione suavemente el aceite mineral hasta que una pequeña gota de aceite se ve saliendo de la punta de la aguja de vidrio.
- Asegurar la aguja de vidrio en el titular de la microinyector.
- Anestesiar el ratón con el 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoetanol + terc-amil alcohol, 1:1 w / v). Dosis de 25 30μL por gramo intraperitoneal.
- Ponga una almohadilla de calefacción en el dispositivo de estereotaxia para mantener la temperatura corporal del animal a 37 ° C.
- Colocar y fijar la cabeza del ratón en el dispositivo de estereotaxia con barras de oído y un soporte para los dientes.
- Limpie la cabeza del ratón con una solución de clorhexidina al 0,1% de gluconato, seguido por el 70% de etanol y 0,1% de gluconato de clorhexidina por segunda vez.
- Incisión en la piel con una hoja de bisturí # 15 de las orejas del ratón a la línea del cráneo Lamba.
- Pulir el cráneo con un algodón para secar la piel y tirar hacia fuera del campo quirúrgico.
- Use la punta de la aguja de vidrio a punto en el vértice de la sutura Bregma. No tienes que definir la posición inicial del inyector (la coordenada "cero").
- Establecer el punto de ser perforado por el movimiento de la "X" e "Y" eje del dispositivo de estereotaxia sobre el cráneo.
- Taladro con mucho cuidado los agujeros en la coordenada seleccionada. Microdrills y otras herramientas de metal fueron esterilizadas previamente a 250 ° C durante 60 segundos con un paño seco de cuentas de vidrio esterilizador (Cole Palmer, cat. N º EW-10779-00).
- Con unas pinzas finas retirar con cuidado la capa más profunda de los huesos y romper la membrana duramatter (verá un poco de líquido cefalorraquídeo se escape).
- Confirmar que la aguja se puede ir a través de los agujeros perforados.
- Pipeta de 1 l de la droga que desee inyectar y lo puso en un pequeño trozo de parafilm.
- Coloque la parafina en el cráneo.
- Aspirar la droga haciendo girar la rueda microinyector, mientras se revisa bajo el microscopio que el líquido se va para arriba en la aguja de vidrio.
- Retire la parafina y volver a configurar el sistema de cero.
- Mover la aguja de las coordenadas seleccionadas, por el titular hasta que la punta de la aguja de vidrio tocar suavemente la superficie del cerebro y establecer la "Z" coordinar a cero.
- Introducir la aguja de vidrio en el parénquima cerebral a una profundidad seleccionada.
- Se inyectan la droga lentamente a una velocidad de ~ 1 nl / seg.
- Cuando se inyecta el volumen deseo, dejar que el medicamento difusa en el parénquima durante 2 min. A continuación, proceder a retirar la aguja suavemente y poco a poco.
- Cola de la herida quirúrgica y remover al animal del dispositivo de estereotaxia y el sacrificio del animal en una jaula de pre-calentado que contiene una cama limpia para la recuperación de la anestesia.
- Para proporcionar analgesia postoperatoria todos los animales recibieron 5 mg / kg por vía subcutánea cada hora Ketorolaco 12 por 24 h.
Los resultados representativos:
Cuando se sigue este protocolo, una inyección muy precisa y se obtiene un trayecto de la aguja muy estrecha minimiza la lesión cerebral. Como un resultado representativo de este método, se inyectan lisofosfatidil colina (lisolecitina) en el cuerpo calloso que produce la desmielinización de los tractos de sustancia blanca 1-4. Para minimizar el daño cerebral producido por la aguja de vidrio, se inyecta sólo el 20 nl de lisolecitina en el cuerpo calloso, pero si los volúmenes necesarios mayores de hasta 200 nl se puede inyectar con el mismo método. Desmielinización se detecta por la ausencia de expresión de proteína básica de mielina en los tractos de sustancia blanca (Figura 2).
Figura 1. Una aguja de vidrio con un diámetro de 50 micras. Distancia entre dos ticks cortoen la escala representa una longitud de 50 micras.
Figura 2. Lisolecitina inyección en el cuerpo calloso. Desmielinización se muestra como una expresión de la proteína básica de mielina no (área punteada). Tenga en cuenta el pequeño tamaño del trayecto de la aguja de cristal (flechas). Bar = 100 m