Este protocolo utiliza un desplegable de ensayo para determinar los niveles de GTPasa RHOC activa dentro de las células.
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Artículo de método
RHOC GTPasa ensayo de activación
En este artículo
Resumen
Resumen
RHOC GTPasa tiene 91% de homología con RhoA GTPasa. Debido a su prevalencia en las células, muchos reactivos y técnicas para la GTPasa RhoA se han desarrollado. Sin embargo, RHOC GTPasa se expresa en las células del cáncer metastásico en niveles relativamente bajos. Por lo tanto, son pocos los RHOC reactivos específicos se han desarrollado. Hemos adaptado un ensayo de activación de Rho GTPasa para detectar RHOC. Esta técnica utiliza una GST-Rho de unión a proteínas de fusión de dominio para sacar activos GTPasa RHOC. Además, se puede cosechar la proteína total en el comienzo de la prueba para determinar los niveles del total (GTP y GDP unido) GTPasa RHOC. Esto permite la determinación de la GTPasa RHOC activa respecto al total de la celda. Varias versiones comerciales de este procedimiento se han desarrollado sin embargo, los equipos comerciales se han optimizado para RhoA GTPasa y por lo general no funcionan bien para RHOC GTPasa. Partes de la prueba han sido modificados, así como el desarrollo de un anticuerpo específico RHOC.
Protocolo
1. Prepare la proteína de fusión GST-
- Stocks de glicerol de bacterias competentes JM109 que contiene la primera N-terminal de 90 aminoácidos de la Rhotekin dominio de unión a Rho (RBD) se subclonó en el vector BamH1/EcoR1 pGEX3x se hacen.
Para garantizar la eficiencia de alta los siguientes pasos deben realizarse para cada experimento. En nuestra experiencia, recién preparada GST-RBD es la clave para un ensayo de GTPasa activación sólido y preciso. - Añadir 50 l (aproximado, no descongelar) de las acciones de glicerol y 50 ml de LB amp y crecer 37 ° C durante la noche con agitación.
- Diluir 1:10 en 500 ml de LB-amp y crecer durant....
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Discusión
El paso más crítico del proceso es la generación de nuevas GST-RBD. No prestar atención a este paso es la razón principal del fracaso. Todos los pasos, desde la generación de la GST-RBD (1,2) a la incubación durante la noche con el lisado celular (2,5), se debe hacer en un solo día. Otro paso importante es asegurarse que hay suficientes células para producir los lisados celulares. Esto es de particular importancia cuando se mira en RHOC GTPasa, que tiende a estar presente en bajos niveles en la célula.
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Departamento de Defensa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 y W81XWH-08-1-0356
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Perlas de glutatión-sefarosa 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Geles Criterion 4-20 % Tris-HCl | Bio-Rad | 345-0032 |
Referencias
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
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Reimpresiones y permisos
