El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser modelada In vitro Utilizando los hidrogeles de poliacrilamida de diferentes incumplimientos.
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Artículo de método
El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles
En este artículo
Resumen
Resumen
La rigidez del tejido es un factor determinante de la función celular, y cambios en la rigidez del tejido son comúnmente asociados con la fibrosis, cáncer y enfermedades cardiovasculares 1-11. Los enfoques tradicionales de biología celular al estudio de la función celular implica el cultivo de células sobre un sustrato rígido (platos de plástico o de vidrio cubreobjetos), que no puede explicar el efecto de una ECM elástica o las variaciones en la rigidez de ECM entre los tejidos. Para crear un modelo in vivo las condiciones del tejido cumplimiento in vitro, y otros utilizan ECM-revestidos hidrogeles. En nuestro laboratorio, los hidrogeles se basan en la poliacrilamida que puede imitar la serie de incumplimientos del tejido biológico visto 12. "Reactiva" cubreobjetos son generados por la incubación con NaOH seguido por la adición de 3-APTMS. El glutaraldehído se utiliza para reticular el 3-APTMS y el gel de poliacrilamida. Una solución de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) y persulfato de amonio se utiliza para la polimerización del hidrogel. N-hidroxisuccinimida (NHS) se incorpora a la solución de CA para reticular las proteínas ECM al hidrogel. Después de la polimerización del hidrogel, la superficie del gel está recubierto con una proteína de elección ECM como la fibronectina, vitronectina, colágeno, etc
La rigidez de un hidrogel puede ser determinada por la reología o microscopía de fuerza atómica (AFM) y ajustado variando el porcentaje de AC y / o AC-bis en la solución 12. De esta manera, la rigidez sustrato se puede adaptar a la rigidez de los tejidos biológicos, que también puede ser cuantificado usando la reología o AFM. Células pueden ser sembradas en estos hidrogeles y cultivadas según las condiciones experimentales necesarias. Imágenes de las células y su recuperación para el análisis molecular es sencillo. Para este artículo, se define sustratos blandos como los que tienen módulos de elasticidad (E) <3000 Pascal y sustratos rígidos / tejidos como aquellos con E> 20.000 Pascal.
Protocolo
Preparación
- Cubreobjetos deben ser esterilizados en autoclave.
- Agua destilada estéril o desionizada se debe utilizar para preparar las soluciones y cubreobjetos de lavado.
- CA (40% w / v) y bis-CA (1% w / v) se esterilizan por filtración 0,2 um. Prepare un 10% de persulfato de amonio (APS, el agua 100μg/ml) poco antes de su uso y filtro estéril. Sustituir la solución APS mensuales.
- Reactivos químicos como el 3-APTMS, cloroformo, glutaradehyde, NHS, y SurfaSil que no pueden ser esterilizados en autoclave se mantienen en una botella asignados utilizados únicamente para la preparación de los hidrogeles.
- Para obtener mejo....
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Discusión
Un elemento crucial del proceso de polimerización de hidrogel es para evitar la formación de burbujas de aire que permiten que las células se unen a la cubreobjetos de vidrio en lugar de que el hidrogel ECM-revestidos en sí. Esto se puede evitar con cuidado pipeteando la solución de polimerización después de agitación y visual asegurándose que no queden burbujas de aire han quedado atrapados en el gel. Nosotros siempre recomendamos la preparación adicional "reactivo" cubreobjetos y los hidrogeles para asegurar.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El trabajo es nuestro laboratorio es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Glutaraldehído, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Almacenar a -20°C |
| 3-APTMS (3-aminopropiltrimetoxisilano 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Almacenar a temperatura ambiente |
| Fluido siliconado SurfaSil | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Almacenar a temperatura ambiente |
| NHS (éster de N-hidroxisuccinimida) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Almacenar a 4°C Reemplazar mensualmente |
| Albúmina de suero bovino, esencialmente libre de ácidos grasos | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Almacenar a 4°C |
| Láminas cubreobjetos (25 mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Láminas cubreobjetos (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Referencias
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
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Reimpresiones y permisos
