Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Resumen

La actividad de la descarboxilasa inducible lisina es controlada por la reacción del sustrato L-lisina y el producto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic ácido para formar aductos que tienen una solubilidad diferencial en tolueno.

Resumen

Escherichia coli es una bacteria entérica que es capaz de crecer en un amplio rango de valores de pH (pH 5-9) ¹ e, increíblemente, es capaz de sobrevivir ácido extremas tensiones incluyendo el paso por el estómago de mamíferos en donde el pH puede caer tan bajo como pH 1 - ² 2. Para permitir una gama tan amplia de la supervivencia de pH ácido, E. coli posee cuatro descarboxilasas diferentes inducible descarboxilación de aminoácidos que los ácidos amino sustrato en forma de protones dependiente de lo que aumenta el pH interno. El descarboxilasas incluyen el ácido glutámico descarboxilasas Gada y GadB ^3, la arginina descarboxilasa Adia ^4, la lisina descarboxilasa LdcI ^{5, 6} y la ornitina decarboxilasa SPEF ^7. Todas estas enzimas utilizan piridoxal-5'-fosfato como un co-factor ⁸ y funcionan en conjunto con la membrana interna de productos sustrato antiporters que eliminar los productos de descarboxilación al medio externo a cambio de sustrato fresco ^2. En el caso de LdcI, el antiporter lisina cadaverina se llama Cadb. Recientemente, se determinó la estructura cristalina de rayos X de LdcI a 2,0 Å, y descubrimos una novela pequeña molécula unida a la guanosina LdcI respuesta regulador estricto 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) ^14. La respuesta estrictas ocurre cuando las células en crecimiento exponencial experiencia de la privación de nutrientes o una de una serie de otros factores de estrés ^9. Como resultado, las células producen ppGpp que conduce a una cascada de señalización que culmina en el cambio de un crecimiento exponencial a fase estacionaria del crecimiento ^10. Hemos demostrado que ppGpp es un inhibidor específico de LdcI ^14. A continuación se describe el ensayo de lisina descarboxilasa, una modificación del ensayo desarrollado por Phan et al. ^11, que hemos utilizado para determinar la actividad de LdcI y el efecto de pppGpp / ppGpp en esa actividad. La reacción de descarboxilación LdcI elimina el grupo α-carboxilo de la L-lisina y produce dióxido de carbono y la cadaverina poliamina (1,5-diaminopentano) ^5. L-lisina y la cadaverina puede reaccionar con el ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) a un pH elevado para generar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) y N, N-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente ^11. El TNP-cadaverina se puede separar de la TNP-lisina como el primero es soluble en disolventes orgánicos como el tolueno y el segundo no lo es (ver Figura 1). El rango lineal del ensayo fue determinado empíricamente por medio purificada cadaverina.

Protocolo

1) Reactivos y Equipos

1. En primer lugar, preparar las tres soluciones siguientes: 1 ml de solución A, que se compone de 8 mM de L-lisina, 100 mM de sodio 2 - (N-morfolino) el ácido etanosulfónico (MES) pH 6,5, 0,2 mM de nucleótidos, que es el nucleótido o bien: difosfato de guanosina (GDP), guanosina trifosfato (GTP), guanosina 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp), o guanosina 5'-trifosfato, 3'-difosfato (pppGpp), 0,1 mM piridoxal 5-fosfato (PLP), y 1 mM β-mercaptoetanol / (β-ME). 1 ml de solución B que consiste en 100 mM de sodio pH 6,5 MES, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, y 50 nM LdcI. LdcI fue purificado como se describe en Snider et al. ⁶ y Kan....

Discusión

En el ensayo de lisina descarboxilasa, TNBS se hace reaccionar con las aminas primarias de L-lisina y la cadaverina para formar TNP-lisina y TNP-cadaverina aductos (Figura 1). Debido a la presencia del grupo ácido carboxílico de TNP-lisina, este aducto permanece soluble en agua, mientras que el TNP-cadaverina, que carecen del grupo ácido carboxílico, es capaz de partición en tolueno ^11. Este tipo de ensayo puede ser utilizado más ampliamente en otros tipos de aminoácidos que la pérdida de un grupo ácido carbo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfónico	Sigma-Aldrich	P2297
0,1 mM pirodóxal 5’-fosfato (PLP)	Sigma-Aldrich	P9255
Cadaverina	Sigma-Aldrich	D22606
Placas de poliestireno de 96 pocillos	Sarstedt Ltd
Placa de cuarzo de 96 pocillos	Hellma
Bloque calefactor digital VWR	VWR international
ThermoStat Plus	Eppendorf
Placas de polipropileno de 96 pocillos de 2,0 mL	Axygen Scientific	P-DW-20-C
Pipeta repetidora Handy Step	Brand GmbH
Puntas para pipeta repetidora de 12,5 mL	Brand GmbH	702378
Lector de placas SpectraMax 340PC	SpectraMax