La región de la corona de las diferentes secuencias V3 bucle de la glicoproteína de superficie (gp120) del VIH-1 puede ser caracterizado estructuralmente en muchos casos en el plegamiento in silico de las posiciones 10 a 22 del ciclo con un estado de la técnica Ab initio Plegables algoritmo. Aquí se demuestra el plegado y la evaluación de esta región del bucle V3 de la cepa R2 del VIH-1, una cepa de neutralización únicamente sensible con desconcertantes propiedades funcionales.
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Artículo de método
Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable
En este artículo
Resumen
Resumen
La diversidad antigénica del VIH-1 ha sido durante mucho tiempo un obstáculo para el diseño de vacunas, y esta variabilidad es especialmente pronunciada en el bucle V3 de la glicoproteína del virus sobre la superficie. Nos habíamos propuesto que la corona de la V3, aunque variable dinámica y la secuencia, se ve limitada en toda la población del virus VIH-1 a un inmunológicamente relevantes β-horquilla estructura terciaria. Es importante destacar que existen miles de diferentes secuencias V3 corona bucle en la circulación de virus VIH-1, por lo que la caracterización estructural en 3D de las tendencias a través de la diversidad de los virus de difícil o imposible por la cristalografía o RMN. Nuestros estudios anteriores con éxito con el plegado de la corona V3 1, 2 utiliza el algoritmo ab initio 3 accesibles en el ICM-Pro paquete de software de modelado molecular (Molsoft LLC, La Jolla, CA) y sugirió que la corona de la V3, específicamente de las posiciones 10 a 22, los beneficios de la flexibilidad suficiente y la longitud de los tallos que flanquean a comportarse en gran medida, como si se tratara de un péptido sin restricciones libremente plegable en la solución. Como plegables, y rápido ab initio de sólo esta porción del lazo V3 de cualquier cepa individual de los 60.000 que circulan cepas VIH-1 pueden ser informativas. En este sentido, dobló el bucle V3 de la cepa de R2 para conocer mejor las bases estructurales de sus propiedades únicas. R2 tiene una secuencia de bucle V3 raro que se cree responsable de la exquisita sensibilidad de esta cepa a la neutralización por el suero de los pacientes y los anticuerpos monoclonales 4, 5. La media tensión CD4 independiente de la infección y parece inducir anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se demuestra cómo la evaluación de los resultados de las plegables pueden ser informativas para la asociación de las estructuras observadas en el plegamiento de las actividades inmunológicas observadas para R2.
Protocolo
1. Metodología
- El primer paso del protocolo es para seleccionar la secuencia de la corona V3 deseas retirarte in silico. Para la cepa R2, la secuencia de este fragmento es KSIPMGPGRAFYT.
- La estructura atómica en 3D del péptido correspondiente a esta secuencia debe ser construido en el espacio virtual de la computadora. El comando de ICM para esto es:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
o Archivo: Nuevo: péptidos se pueden seleccionar en el menú desplegable - Varios parámetros del procedimiento A continuación se establecen, incluyendo el número de pasos de búsqueda (la longitud de la búsqueda), la temperatura de la simulación, los parámetros de la estrategia de búsqueda incluido el control variable de sesgo de la búsqueda hacia las zonas razonable, términos de energía, selección de diferentes métodos de cálculo de la energía, y los parámetros que indican cómo la búsqueda se registrarán como si para grabar una película y el número de conformaciones intermedias de puntuación deben ser registrados. Todos estos parámetros han sido optimizados por publicaciones anteriores (ver www.molsoft.com).
- El plegado se inició a continuación con el comando:
montecarlo
o Archivo: Nuevo: péptidos se pueden seleccionar en el menú desplegable de Mecánica Molecular: Minimizar: Global
En el primer caso, los parámetros del paso 3 se debe establecer uno por uno en la línea de comandos. En este último caso, casillas de verificación de los parámetros más comúnmente elegido se proporcionan en un panel antes de que el comando es ejecutado. Para mayor comodidad, el mismo guión de plegado ICM utilizada para este experimento y los experimentos publicados anteriormente se muestra aquí:
Este script se puede guardar en un archivo de texto y se ejecuta desde la línea de la computadora de comandos del sistema operativo (generalmente Linux) rápidamente con el comando:
icm _foldingscript
2. Secretos para el Éxito
- El V3 es una constante 35 aminoácidos de longitud en casi todas las cepas conocidas, por lo que las posiciones de aminoácidos se numeran desde 1 hasta 35 a partir del disulfuro de origen en condiciones de servidumbre de cistina en 1 y terminando con el disulfuro de cistina en condiciones de servidumbre correspondientes a los 35. Ya que es parte de un circuito, los límites de la corona de la V3 deben ser elegidos cuidadosamente. Si es demasiado grande es un fragmento elegido, es poco probable que se comporte como un segmento libremente flexibles, como si se tratara de un péptido libre, por lo que la simulación de plegado presenta problemas para evaluar la estructura. Si es demasiado pequeño fragmento que se elija, la estructura terciaria de carácter informativo no se puede formar en la simulación. Nuestro estudio anterior mostró que el fragmento de la posición 10 a la posición 22 correlacionado con anticuerpo unido conformaciones cristalográfica, por lo que este es el fragmento de un V3 que se debe elegir para el plegado.
- A pesar de los menús usando la interfaz gráfica de usuario y pull-down es fácil de usar, el trabajo previo con éxito en el plegamiento de péptidos en general con ICM y V3 loop corona plegable, en particular, utiliza el programa anterior, simplemente modificando la secuencia en la línea de buildpep y ejecución de la secuencia de comandos desde la línea de comandos, se recomienda.
3. Resultados representante
Los resultados para el plegado R2 son representativos de los resultados de cualquier lazo V3. Para evaluar los resultados, el archivo de proyecto (que se llamará "newProject1.icb" de la secuencia de comandos) deben ser abiertos y "Mecánica Molecular, Pila, Ver" elegido. Una tabla de las conformaciones de la pila aparecerá. Las conformaciones de pila se puede visualizar gráficamente haciendo clic en el icono de la Parcela / Histograma. "Mecánica Molecular, Pila, Play" hará una película de la pila de apreciar visualmente las preferencias conformacionales descubierto por el plegamiento. Para la secuencia de R2, la conformación es beta-horquilla-como era de esperar, como para los bucles V3 2 - sobre todo en el fragmento en las posiciones 12 a 14, donde se ve una clara preferencia de β-cadena a través de la pila, y conformaciones helicoidales alfa-muy pocos se ven. Por otra parte, una brecha de energía de casi 3 unidades se ve entre la conformación de energía más bajo y el segundo más bajo de conformación de la energía. Desde el punto de vista energético, lo que significa que la única estructura que parpadea de la conformación de energía más bajo a menos de un uno por ciento del tiempo: los resultados de plegado por lo tanto, sugieren que el V3 R2 corona es una rígida, en lugar de estructura flexible,. Puede haber más características estructurales importantes en el conjunto de conformaciones, pero son difíciles de apreciar de manera sistemática.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Tabla 1: neutralización relativa de JRFL y V3 R2 bucles en entornos máscara o sin máscara. Los datos se informó anteriormente en Cardozo T., et al. ARHR (2008) y Pinter, A., et. al J. Virol (2004). En pocas palabras, la actividad neutralizante se determinó con un ensayo de infectividad de un solo ciclo de uso de vibradores genera con el env-defectuoso luciferasa que expresan pNL4-3.Luc.RE plásmido pseudotyped con la Env JRFL o el SF162 V3 variantes descritas anteriormente: SF162_V3JRFL contiene el JRFL V3 secuencia de bucle en lugar de la secuencia de bucle SF162 V3. SF162_V3R2 contiene la secuencia de bucle V3 R2 en lugar de la secuencia de bucle SF162 V3. El PSV se incubaron con diluciones seriadas del mAb 447-52D de 1,5 horas a 37 ° C, y luego agregó a CD4 + CCR5 + U87 células diana se sembraron en placas de 96 pocillos en presencia de polibreno (10 mg = ml). Después de 24 horas, las células fueron realimentado con medio RPMI con 10% de SFB y 10 mg = polibreno ml, seguido de un adicional de 24 a 48 h de incubación. La actividad luciferasa se determinó después de la infección 48-72 h con un luminómetro microplaca (HARTA, Inc.), utilizando reactivos de análisis de los títulos de Promega, Inc. media geométrica para el 50% de neutralización (GMT50) por 447-52D se determinarán por interpolación de las curvas de neutralización y son los promedios de al menos tres ensayos independientes.
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Discusión
Plegables ab initio revela terciario propiedades estructurales, cuyos efectos pueden no ser evidentes a partir del estudio de aminoácidos individuales de forma secuencial. Varias propiedades estructurales anteriormente oscuro de la V3 R2 bucle corona son reveladas por la simulación de plegado. Estas preferencias estructurales observadas se pueden correlacionar con observaron las propiedades funcionales de la cepa de R2, es decir, la sensibilidad a la neutralización y hyperinfectivity 5.
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Bill y Melinda Gates Foundation (# 38 631) y los NIH, incluyendo DP2 OD004631 y AI084119 R01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
Referencias
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
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Reimpresiones y permisos
