En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo plazo Ex-ovo Cultivo de embriones de aves. Esta técnica es ideal para la experimentación longitudinal que requiere la plena accesibilidad ópticos y / o transporte de estériles en embriones de aves.
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Artículo de método
Un Ex-ovo Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía
En este artículo
Resumen
Resumen
Entender las relaciones entre factores genéticos y microambientales que impulsan el desarrollo embrionario normal y malformaciones es fundamental para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas. Los avances en tecnología de imagen han permitido a la investigación cuantitativa de la organización y la maduración de la estructura corporal, pero la morfogénesis embrionaria en una etapa posterior es menos clara. Embriones de pollo es un animal vertebrado atractivo sistema de modelo para esta aplicación debido a su facilidad de la cultura y la manipulación quirúrgica. Principios de los embriones pueden ser cultivadas por un corto tiempo en los anillos de papel de filtro, que permite el acceso completo óptico de patrones celulares y 1,2 destino estudios. El estudio de procesos avanzados de desarrollo tales como la morfogénesis cardíaca se realiza tradicionalmente a través de una ventana de la cáscara del huevo 3-5, pero esta técnica limita el acceso óptico debido a tamaño de la ventana. Anteriormente hemos desarrollado un método simple para la cultura embriones enteros ex ovo en el hexagonal pesar barcos de hasta 10 días, lo que permitió imágenes de alta resolución a través de la ecografía 6,7. Estos cultivos fueron difíciles de transportar, lo que limita los tipos de herramientas de imágenes disponibles para los experimentos en vivo. Presentamos aquí una mejora de caparazón sistema de cultivo con un costo-efectivo, cámara ambiental portátil. Los huevos estaban rotas en una hamaca, creada por una membrana de poliuretano (film transparente) fijado circunferencialmente a una taza de plástico llena parcialmente con agua estéril. Las dimensiones de la circunferencia y la profundidad de la hamaca fueron fundamentales para mantener la tensión de la superficie, mientras que la mecánica de la hamaca y el agua por debajo ayudado a amortiguar las vibraciones inducidas por el transporte. Un tamaño pequeño baño de agua circulante también fue desarrollado para permitir un control continuo de la temperatura durante la experimentación. Se demuestra la capacidad de cultivar los embriones de esta manera por lo menos 14 días sin defectos o retraso morfogénica y emplear este sistema en varias de microcirugía y aplicaciones de imágenes.
Protocolo
1. Ex-ovo Cultura Protocolo:
- Incubar huevos de gallina fertilizados
- Fecundados los huevos de gallina se puede almacenar a 13 ° C hasta 5 días antes de la incubación sin iniciar el desarrollo. Un enfriador de vino tinto puede mantener esta temperatura.
- Incubar los huevos lado romo en un 60% de humedad constante incubadora con la oscilación continua a 37,5 ° C durante 72 horas.
- Preparar hamacas (Figura 1a)
- Llene ¾ de 9 oz vasos de plástico con agua estéril tibia. Un habitual 9 oz taza tiene un diámetro máximo de 8 cm. Hemos encontrado que este tamaño era el más adecuado pa....
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Discusión
Acceso óptico y la experimentación en embriones de aves es un reto debido a las limitaciones de la cáscara del huevo. Ventanas limita de manera significativa el número de acceso para métodos de inyección y de microcirugía 8 microvasos. Como resultado de ello sólo embriones pueden ser manipulados y la observación continua no es posible. Los primeros ex-ovo culturas utilizando placas de Petri eran de uso limitado debido al control inadecuado de la tensión superficial sobre el embrión impedido la cultur.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos fértiles de gallina Leghorn blanca | |||
| Modelo GB1, incubadoras Avery Inc., Hugo CO | |||
| Papel plástico Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Corporación Kimberly-Clark | ||
| Ligas de hule | |||
| Agua estéril tibia | |||
| Vaso plástico de 9 oz | |||
| Placa de Petri de 100 mm de diámetro | |||
| Aire térmico 1602N | GQF Manufacturing | ||
| Dextrano conjugado con fluoresceína (2 MDa, 1 % p/v en solución salina tamponada con fosfato) | Sigma-Aldrich | ||
| Microfórceps | Glassworx, Inc., St. Louis MO | ||
| Tubos capilares de vidrio (0,75 mm de diámetro interno) | |||
| Micromanipulador | World Precision Instruments, Inc. | Modelo M3301L | |
| Microscopía de fluorescencia | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Pinzas finas de 55 grados | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Sutura quirúrgica de nylon 10-0 | Ethicon Inc. | ||
| Tubo | VWR International | 1 mm de diámetro externo | |
| Jeringa de 3 mL | BD Biosciences | ||
| Pipeta de 200 μL y puntas para pipeta | VWR International |
Referencias
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E.
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Reimpresiones y permisos
