Ofrecemos un método para aislar y cultivar las poblaciones puras de células endoteliales de la válvula del corazón (VEC). VEC puede ser aislada de uno y otro lado de la cúspide o el prospecto e inmediatamente después, las células intersticiales de base (CIV) aislada es muy sencillo.
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Artículo de método
Aislamiento de células endoteliales valvular
En este artículo
Resumen
Resumen
Las válvulas del corazón es el único responsable de mantener el flujo de sangre unidireccional a través del sistema cardiovascular. Estos tejidos finos y fibrosos están sometidas a importantes tensiones mecánicas que pueden abrir y cerrar miles de millones de veces durante un período de vida. La increíble resistencia de estos tejidos se debe a la residencia del endotelio valvular (VEC) y las células intersticiales (VIC) que constantemente la reparación y remodelación en respuesta a las señales mecánicas y biológicas. Sólo recientemente hemos comenzado a comprender los comportamientos únicos de estas células, por lo que la experimentación in vitro ha jugado un papel clave. Especialmente difícil es el aislamiento y cultivo de VEC. Especial cuidado se debe utilizar desde el momento en que se extirpa el tejido del huésped a través de revestimiento final. Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento directo, aislamiento secundarios específicos, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de VEC. Usamos la digestión enzimática seguida de una técnica de raspado suave esponja para separar las células en la superficie. Estas células son luego recogidos en un tubo y se centrifuga en una pastilla. El pellet se resuspende entonces y se colocaron en frascos de cultivo pre-recubiertos con colágeno I de la matriz. Fenotipo VEC es confirmado por el contacto inhibe el crecimiento y la expresión de marcadores endoteliales específicos, tales como PECAM1 (CD31), Factor Von Willebrand (FVW), y la expresión negativa de la actina de músculo liso alfa (α-SMA). Las características funcionales de VEC se asocian con altos niveles de LDL acetilada. A diferencia de las células endoteliales vasculares, VEC tiene la capacidad única de transformarse en mesénquima, que normalmente ocurre durante la formación embrionaria de la válvula 1. Esto también puede ocurrir durante el confluente de manera significativa después de prolongados en cultivo in vitro, así que el cuidado debe ser de paso o cerca de su confluencia. Tras el aislamiento VEC, poblaciones puras de VIC pueden ser fácilmente adquiridas.
Protocolo
1. Preparación
- Autoclave en un instrumento bandeja cubierta los siguientes elementos:
- Dentada con fórceps del tejido - Para el manejo de los tejidos folleto
- Tijeras de tejidos (8 cm) - Para cortar el tejido folleto y las cúspides
- Los hisopos de algodón - Para aislar la capa endotelial de la hoja o cúspide
- Hacer una solución estéril de colagenasa
- Añadir 4,0 gramos de polvo DMEM a 250 ml de 18 mW de agua.
- Añadir 1,11 gramos de bicarbonato de sodio.
- Añadir (600 U / mL) 180.000 unidades de la colagenasa.
- Añadir al 1% (3 ml) de penicilina / estreptomicina.
- Ajustar ....
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Discusión
La comprensión de la biología valvular se ha visto afectada por las dificultades técnicas de aislamiento y cultivo de poblaciones puras de células endoteliales valvular. Técnicas típicas de aislamiento implican digestión enzimática de la matriz subyacente basal o químicos de disociación de las uniones adhesivas endotelial 2,3. Los experimentos preliminares de aislamiento se evaluaron cualitativamente mediante la variación de los agentes de la disociación y el período de incubación. Los resultados de estos exp.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Esta investigación es apoyada por el premio CARRERA NSF, la Fundación Hartwell, y la Asociación Americana del Corazón (# 0830384N).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio de Eagle Modificado de Dulbecco’s | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Suero Bovino Fetal | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicilina Estreptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Tripsina-EDTA al 0,25% | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Sal de Sodio de Heparina | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Colagenasa Tipo 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Colágeno de Cola de Rata | BD Biosciences | 354236 | |
| Hisopos Críticos | VWR international | 89031-270 | |
| Bicarbonato de Sodio | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| Frascos T25 | BD Biosciences | 353018 | |
| Frascos T75 | BD Biosciences | 353136 | |
| Placa de 24 Pozos | Falcon BD | 353047 | |
| Placas de 60x15 mm | VWR international | 25384-092 | |
| Placas de Vidrio de 60x15 | VWR international | 89000-310 | |
| Cera para Inclusión en Parafina | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Agujas Precision Glide | BD Biosciences | 305165 | |
| Filtros Nalgene de 500 mL | VWR international | 73520-985 | |
| Filtros Nalgene de 1 L | VWR international | 73520-986 | |
| Pinzas para Tejidos | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| Pinzas FSC n.º 5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
Referencias
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N.
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Reimpresiones y permisos
