Artículo de método

Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

DOI:

10.3791/2196

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22 de septiembre de 2010

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1Department of Microbiology, University of Tennessee

En este artículo

Resumen

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La tasa de rotación de los virus en los sistemas marinos y de agua dulce puede ser estimado por una reducción de la recurrencia y la técnica. Los datos permiten a los investigadores a deducir las tasas de mortalidad microbiana mediada por el virus en los sistemas acuáticos.

Resumen

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Los virus son los componentes generalizada de los sistemas marinos y de agua dulce, y se sabe que son importantes agentes de la mortalidad microbiana. El desarrollo de estimaciones cuantitativas de este proceso es fundamental, ya que se puede desarrollar mejores modelos de estructura de la comunidad microbiana y la función, así como avanzar en nuestra comprensión de cómo los virus de trabajo para alterar los ciclos biogeoquímicos acuáticos. La técnica de reducción de virus permite a los investigadores estimar la velocidad a la que las partículas de virus son liberados de la comunidad microbiana endémicas. En resumen, la abundancia de libre (extracelular) virus se reduce en una muestra, mientras que la comunidad microbiana se mantiene en la concentración ambiente cerca. La comunidad microbiana se incuba en la ausencia de virus libre y la velocidad a la que volver a aparecer los virus en la muestra (a través de la lisis de los miembros que ya están infectadas de la comunidad) se puede cuantificar mediante microscopía de epifluorescencia o, en el caso de los virus específicos, cuantitativos PCR. Estas tarifas se pueden utilizar para estimar la tasa de mortalidad microbiana, debido a la lisis celular mediada por el virus.

Protocolo

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1. Ultrafiltración de agua de mar para generar "libre de virus" de agua (Wilhelm y Poorvin 2001)

  1. Aproximadamente 20 litros de agua de mar / agua del lago se recoge como asépticamente posible.
  2. El agua es prefiltrado en serie a 142 mm de diámetro de policarbonato 0,8 micras filtros que se pueden guardar a -20 ° C para el análisis de la comunidad. Los filtros más grandes de tamaño de poro se puede utilizar antes de este paso para los sistemas muy productivos.
  3. Para obtener agua ultrafiltrada de un sistema de M12 Amicon (Millipore) se utiliza un 30 kDa de corte de cartucho espiral de excluir a todos los virus, incluso los pequeños virus de ARN.
  4. Las muestras se procesan y se concentran en la velocidad de ~ 25% ~ 15 a 16 kPa de contrapresión.
  5. El resto de la muestra de ~ 500 ml de agua contenga una comunidad virus concentrado (que se pueden guardar para otros experimentos), mientras que el restante 19,5 L de agua libre de virus serán utilizados para los ensayos de la producción viral.
  6. Después de cada día de uso, el Amicon M12 sistema debe ser limpiado para prevenir el daño a la membrana del cartucho de filtro.
  7. Si está trabajando con el mar, lave la membrana con por lo menos 6L de agua Milli-Q seguido de un lavado con una solución de NaOH 0,1 N durante 30-45 minutos.
  8. Otra vez aclarado el cartucho con un mínimo de 6 L de agua Milli-Q.
  9. Cuando termine de usar el sistema de M12, el cartucho espiral debe ser almacenado en un 0.05MH 3 PO 4 solución a 4 ° C.

2. Virus Método de reducción de la producción viral (Wilhelm et al. 2002)

  1. Hasta 500 ml de la muestra de agua de mar / agua del lago con el host y los virus se obtiene y se coloca en una unidad sterifilter con un 0,2 micras de tamaño de poro nominal baja unión a proteínas de filtro (por ejemplo, Durapore) en el mismo.
  2. La muestra es ligeramente vacío presión a <200 mmHg, mientras que continuamente resuspender la muestra con una pipeta de transferencia estéril para inhibir las células bacterianas de concentrarse en el filtro.
  3. Poco a poco los tres volúmenes de ultrafiltrado se añaden a la suspensión de bacterias para reducir significativamente el número de virus libre en la muestra.
  4. La fracción bacteriana, se diluye de nuevo a 500 ml con agua libre de virus y se divide en tres repeticiones de 150 ml cada uno y se colocan en botellas de policarbonato transparente de 250 ml.

3. Filtración tangencial de flujo (TFF) Método para la producción viral (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)

TFF representa un enfoque alternativo para el método de reducción viral.

  1. Aproximadamente 500 ml de muestra natural se obtiene como se describe anteriormente.
  2. Esta muestra se concentra con un 0,2 micras de tamaño de poro nominal del sistema de filtración tangencial de flujo.
  3. Cuando la fracción bacteriana se reduce a aproximadamente 10-15 ml, ultrafiltrado, libre de virus se añade agua y se distribuye de arriba.
  4. Las botellas se incuban a replicar en condiciones in situ con cámaras ambientales.
    1. Los niveles de luz se alteran las condiciones de la superficie mediante el uso de tinte azul acrílico acrílico o con clara proyección neta para disminuir la intensidad de la luz.
    2. La temperatura ambiente de superficie se obtienen a menudo mediante el uso de agua de mar que fluye cubierta incubadora.
  5. Las muestras para las estimaciones de abundancia bacteriana y viral se toman en el momento 0, con una concentración final de 2,0 a 2,5% de glutaraldehído estéril añadido en crioviales. Estas muestras son inmediatamente flash congelado con nitrógeno líquido y se almacenan congelados hasta su transformación.
    1. Si el nitrógeno líquido no está disponible, portaobjetos se pueden preparar y procesar inmediatamente (consulte el siguiente procedimiento)
  6. Submuestras se recogen cada 2,5 horas por lo menos 10 horas por el método descrito anteriormente.
    1. En este tiempo el agua puede ser recogida para análisis de PCR cuantitativa. Hasta 5 ml de la muestra se pueden añadir a un criovial con ningún agente fijador con flash que congela inmediatamente en nitrógeno líquido.

4. Microscopía de producción viral (Noble y Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)

  1. Las muestras congeladas a ser de 0,02 m filtrada para microscopía se deben descongelar en hielo.
  2. Prepare una solución de reserva de SYBR Green por dilución de la solución madre 1:10 con agua estéril. A continuación, a partir de la solución madre, preparar una solución de trabajo mediante la adición de 1 ml de la solución a 39 ml de agua estéril. Un 50% de glicerol, el 50% de tampón fosfato soluciones salinas (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% de NaCl, pH 7,5) y la nueva solución al 2,5% de valores de p-fenilendiamina también deben estar preparados antes de empezar. Mantener el 50% glycerol/50% de solución PBS a 4 ° C y la phenylenediam p-INE acciones a -20 ° C en la oscuridad hasta que arranque. Justo antes de agregar el filtrado de p-fenilendiamina al PBS 50% glycerol/50% hasta una concentración final de 0,1% para ser usado como la solución Antifade.
  3. Lugar de 25 mm de 0,02 micras filtro Anodisc en la parte superior de un MicronStep de 0,45 micras, filtro de respaldo de celulosa. Añadir 850 l de la muestra fijada a la parte superior de la Anodisc y vacío a 20 pKa hasta que esté completamente seca. Colocar 100 L de solución de SYBR Verde de trabajo a una placa de Petri estéril y, con el vacío en pie, retire con cuidado la Anodisc de la torre de filtro y el lugar en el SYBR Green. Incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Retire con cuidado el filtro de la solución de SYBR Green y la mecha de la parte posterior del filtro con un Kimwipe para eliminar todo el colorante residual. Si lo desea, el filtro de retorno a la torre y pasar hasta 800 l de agua filtrada de 0,02 micras, o los medios de comunicación a través del filtro estéril para enjuagar el exceso de colorante.
  4. Añada una pequeña gota de solución Antifade a un portaobjetos de microscopio y colocar una hoja de cubierta en la parte superior. Retire la hoja de la cubierta y agregar el filtro se seca a la húmeda portaobjetos con la solución Antifade. Una vez más, añadir una pequeña cantidad de solución Antifade a la hoja de la cubierta y poco a poco lugar en la parte superior del filtro, asegurándose de eliminar todas las burbujas que se forman.
  5. Inmediato congelamiento de los portaobjetos a -20 ° C hasta su utilización (estos deben ser utilizados en varios meses para evitar decoloración y la baja cuenta de virus)
  6. Los virus se enumeran utilizando microscopía de fluorescencia (en nuestro caso un microscopio Leica DMRXA) con una amplia gama de conjunto filtro azul (λ Ex = 450 a 490 nm, λ Em = 510 nm con un filtro de supresión en λ = 510 nm). Cada filtro tendrá por lo menos 20 campos de visión en cuenta, asegurándose de cuantificar virus total de cada red de campo para asegurar una distribución uniforme de los virus a través de la membrana del filtro.
  7. Las tasas promedio de recurrencia del virus de la independiente de tres repeticiones se calculan y una desviación estándar se determina a partir de las tasas de producción.

5. Resultados representante

Los datos originales recopilados por el investigador requiere un mínimo de procesamiento matemático para generar tasas de recurrencia de la abundancia de virus. El conjunto de datos primarios resultantes de este estudio es la tasa de recurrencia de la abundancia de virus en las sub-muestras de la incubación. Estos resultados forman regresiones independientes del tiempo frente a virus de la abundancia para cada una de las muestras. Para cada muestra, las incubaciones individuales actúan como un tratamiento, por lo que al completar tres replicar-incubación, el investigador puede calcular las tasas, así como una estimación de la variación (por ejemplo, la desviación estándar) (ver Figura 1).

Una advertencia de este proceso es que la reducción en la abundancia invariable virus lleva a una reducción en las células huésped en la muestra que se están llevando la carga de virus. Para compensar esta pérdida, la enumeración de la abundancia de bacterias de la fuente (agua de mar no filtrada o agua del lago) y la T = 0 muestra de incubación son necesarios. Esta información puede ser utilizada para tener en cuenta el porcentaje de células perdidas: en el supuesto de que el proceso de reducción de la abundancia de virus no es selectivo a favor o en contra de los miembros de la comunidad microbiana, este factor puede ser utilizado para estimar la tasa de producción in situ de los virus .

Figura 1
Figura 1. La producción de las muestras de partículas similares al virus más de una incubación de 10 horas en condiciones in situ mediante microscopía de epifluorescencia. Fueron recogidos durante una floración de fitoplancton en las costas de Nueva Zelanda en septiembre de 2008.

Figura 2
Figura 2. Diagrama esquemático del proceso de flujo de trabajo para el ensayo de producción de virus. El proceso comienza con la ultrafiltración de la muestra de agua para generar agua libre de virus. Esto se completa con un sistema de ultrafiltración. En muestras de agua en paralelo se recogen en el mismo sitio y el virus sin pasar por un filtro, mientras que la comunidad microbiana (que contiene una mezcla de las células infectadas y no infectadas) se mantiene. Esta comunidad es luego resuspendido en agua libre de virus y se incubaron en condiciones in situ. La tasa de recurrencia de los virus es de cerca por las próximas 10 horas para determinar las tasas de producción de virus.

Discusión

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Un componente fundamental en la comprensión de cómo los virus de la influencia marina comunidades microbianas es determinar la velocidad a la que se producen partículas de virus. Dado que la abundancia es (más o menos) en la mayoría de los sistemas estáticos (Wilhelm y Suttle 1999, Weinbauer 2004), y que los virus son eliminados o convertidos en no infecciosos rápidamente en los sistemas acuáticos (Wilhelm et al. 1998), entonces las tasas de producción debe ser relativa rapidez para sustituir a las partículas perdidas.

Estimación de los virus de la mortalidad por cualquier causa a la comunidad microbiana requiere un conocimiento de cómo muchos de los virus se producen cada vez que un virus de la lisis de una célula (el "tamaño de la ráfaga"). Tamaños virus irrumpió en las muestras naturales pueden variar mucho. Tamaños de ráfaga puede ser determinada directamente por microscopía electrónica de transmisión (por ejemplo, Weinbauer Peduzzi y 1994), pero esto es a menudo más allá de las capacidades de un determinado laboratorio o no siempre es práctico. En situaciones en las que no puede ser determinada empíricamente, los valores de la literatura de los 24 virus por evento líticas pueden ser utilizados para los sistemas marinos y 34 para los sistemas de agua dulce (Parada et al. 2006). Si la tasa de producción de virus se divide por este número, el resultado es la abundancia de células por unidad de volumen destruido por el virus en una base diaria. Los microbios lisadas valor puede ser dividido por la población permanente de la abundancia bacteriana que resulta en la mortalidad inducida por el virus para el sistema en cuestión: las estimaciones van existentes de porcentaje a casi toda la población y son a menudo dependen de otros factores en el sistema en cuestión (Wilhelm y Matteson 2008). Para determinar el porcentaje de la mortalidad total, este número se multiplica por dos veces (de trabajo a partir de la suposición de que el 50% de las células van a reproducir y el 50% de las células se pierden, Weinbauer 2004).

Dado que la biodisponibilidad de nutrientes y elementos traza (por ejemplo, N, P, Fe) puede limitar la tasa de productividad primaria, y como tal el flujo de carbono, a través de los sistemas acuáticos, y la comprensión del papel de la mortalidad microbiana virus basada en este proceso se ha convertido en de interés para los geoquímicos marinos. Varias estimaciones sugieren que ahora existen los virus de liberar una concentración significativa de los elementos nutrientes de vuelta a la columna de agua sobre una base diaria (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) y que estos elementos son rápidamente asimilados por la comunidad microbiana (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). La tasa de flujo de nutrientes al medio ambiente se puede determinar multiplicando el número de células destruidas por la cantidad de nutrientes por la célula (denominado "cuotas"). Esta información puede ser un componente crítico para nuestra comprensión de cómo las redes microbiana de alimentos funcionan a través de los sistemas acuáticos.

La evolución en curso: Los esfuerzos actuales por una serie de grupos de investigación incluyen la adaptación de la estrategia anterior para enumerar los virus específicos de la comunidad y, como tal, para determinar cómo los organismos específicos están influidos por la actividad del virus. Para ello los investigadores utilizan la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) para estimar la abundancia de los grupos de virus específicos o familias de forma paralela a las estimaciones de la comunidad total de virus. Los resultados son de aplicación directa para proporcionar estimaciones de la mortalidad del virus, ciclos de nutrientes, etc para grupos específicos de plancton. Este nuevo enfoque permitirá a los investigadores de gran alcance en los próximos años para excavar más profundamente en los procesos relacionados con la ecología de los virus y, por primera vez, para cuantificar las interacciones específicas de virus-huésped comunidades más allá de las limitaciones de los sistemas de laboratorio.

Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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La publicación de este artículo fue financiada por una beca de la Oficina de Investigación de la Universidad de Tennessee. Los autores agradecen a la anterior generación de estudiantes e investigadores que han trabajado para perfeccionar esos procedimientos. La investigación fue financiada por becas de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-0851113, NSF-0825405 y 0550485, NSF).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2.5% p-fenilendiaminaAcros Organics130575000Solución stock para antifade
Sistema Amicon Proflux M12EMD MilliporeN/APuede utilizarse cualquier dispositivo de ultrafiltración para este paso
Tinción con SYBR Green I para geles de ácidos nucleicosInvitrogenS-7563
Filtro Helicon S10 de 30 kDaEMD MilliporeCDUF010LT
Filtros Pelicon XL de 0,22 μmFisher ScientificPXGVPPC50
Filtros de membrana PCTE de GE de 0,2 μm (47 mm)Fisher Scientific09-732-35
Sistema de filtración tangencial Millipore LabscaleEMD MilliporeXX42LSS11Pueden utilizarse otros sistemas de filtración tangencial (TFF) para este paso
Filtros micrométricos celulósicos blancos de 0,45 μm (25 mm)Fisher ScientificE04WP02500
Filtros Anodisc de GE Whatman de 0,02 μm (25 mm)Fisher Scientific68-09-6002
Microscopio Leica DMRXAPuede utilizarse cualquier microscopio de epifluorescencia con un juego de filtros azules
Bidones de policarbonato de 20 LFisher Scientific
GlicerolFisher ScientificBP229-4
PBS (Na2HPO4 0,05 M, NaCl al 0,85%, pH 7,5)Fisher ScientificBP329-500, S640-500
Glutaraldehído al 50%Fisher ScientificG151-1
Viales criogénicos Corning de 2 mL, polipropileno con rosca externaFisher Scientific09-761-71Pueden utilizarse cualquier tipo de viales criogénicos
Viales criogénicos Corning de 5 mL, polipropileno con rosca externaFisher Scientific09-761-74Pueden utilizarse cualquier tipo de viales criogénicos
H3PO4 al 85%Fisher ScientificA242-212Almacenamiento de membrana espiral
Escamas de NaOHFisher ScientificS318-3Limpieza del M12
Probetas graduadas
Filtro de membrana Isopore con tamaño de poro de 0,8 μm (142 mm)EMD MilliporeATTP14250
Soporte de filtro de acero inoxidable de Millipore (142 mm)Fisher ScientificYY30 090 00

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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