En este artículo se pretende describir en forma gradual el uso común In vitro Métodos de evaluación utilizados en el estudio de la célula de Schwann-asrtocyte interacciones.
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Artículo de método
El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células de Schwann son una de las celdas habitualmente utilizadas en las estrategias de reparación después de lesiones de la médula espinal. Las células de Schwann son capaces de soportar la regeneración axonal y el brote de crecimiento secretan factores de crecimiento de 1,2 y ofrecer la promoción de tres moléculas de adhesión y moléculas de la matriz extracelular 4. Además se mielinizar los axones mielina en el sitio de la lesión 5.
Sin embargo después del trasplante, las células de Schwann no migran desde el sitio de implante y no se mezclan con los astrocitos de acogida 6,7. Esto se traduce en la formación de una frontera clara entre las células de Schwann y astrocitos, creando un obstáculo para los axones en crecimiento tratando de salir de la parte posterior del injerto en el tejido del huésped proximal y distal. Los astrocitos en contacto con las células de Schwann también se someten a la hipertrofia y un máximo de regular las moléculas inhibidoras 08.13.
En ensayos in vitro se han utilizado para modelar la célula de Schwann, astrocitos y las interacciones han sido importantes en la comprensión de los mecanismos subyacentes al comportamiento celular.
Estos ensayos in vitro son los límites del ensayo, donde se hizo un co-cultivo con dos células diferentes con cada tipo de célula que ocupan territorios diferentes con sólo una pequeña brecha que separa los dos frentes de la célula. Como las células se dividen y emigran, los dos frentes celular se acercan el uno al otro y finalmente colisionan. Esto permite que el comportamiento de las dos poblaciones celulares que se analizan en la frontera. Otra variante de la misma técnica que consiste en mezclar las dos poblaciones celulares en la cultura y con el tiempo los dos tipos de células segregan con las células de Schwann se agruparon como islas en medio de los astrocitos en conjunto la creación de múltiples Schwann, astrocitos límites.
El segundo ensayo utilizados en el estudio de la interacción de dos tipos de células es el ensayo de la migración, donde puede ser rastreado movimiento celular en la superficie del tipo de células en monocapa 14,15. Este ensayo se conoce comúnmente como ensayo cubreobjetos invertido. Las células de Schwann se cultivan en pequeños fragmentos de vidrio y se invierten boca abajo sobre la superficie de las monocapas de astrocitos y la migración se evalúa desde el borde del cubreobjetos.
Ambos ensayos han sido fundamentales en el estudio de los mecanismos subyacentes que implica la exclusión celular y la formación de frontera. Algunas de las moléculas identificadas mediante estas técnicas, como las N-cadherinas 15, condroitina sulfato proteoglicanos (CSPGs) 16,17, FGF / Heparina 18, Efe / Efrinas 19.
En este artículo se pretende describir ensayo límite y ensayo de migración en forma gradual y aclarar los posibles problemas técnicos que pudieran ocurrir.
Protocolo
1. Límite del ensayo:
- Preparación básica: la cámara de diapositivas están recubiertas con poli-D-lisina portaobjetos de vidrio durante la noche y estériles se preparan antes de comenzar el experimento. Medio se prepara con Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS), y el 1% penicilina-estreptomicina-Fungizon (PSF). También una botella de libre Calcio / Magnesio solución salina balanceada de Hanks (HBSS) se prepara.
- Primaria las células de Schwann de rata en cultivo en frasco se trypsinized durante 3 minutos con 0,1% de tripsina. Cultivos primarios de astrocitos de rata se trypsinized durante 5 minutos con 0,1% de tripsina.
La tripsina es inactivado mediante la adición de DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% de PSF. - Trypsinized células de Schwann y astrocitos se transfieren a separar 15 ml tubos falcon y se centrifuga a 300 G durante 5 minutos.
- Las células de Schwann y astrocitos están nuevamente en suspensión en la densidad de 2 x 10 6 (ver sección de resultados representativos de las variaciones en la densidad celular).
- 50 l gota de suspensión de células de Schwann se coloca en un extremo del PDL pozos revestidos cámara de diapositivas. Una tira de cristal que se utiliza para desprestigiar a la caída hacia el centro de la cámara para generar un borde recto. (Usando un cortador de vidrio, un cubreobjetos de vidrio rectangular se cortan longitudinalmente, de manera que se ajuste al ancho de la cámara de diapositivas utilizadas para los ensayos de límite)
- Una segunda caída de 50 l de la suspensión de los astrocitos se colocó en el extremo opuesto de la misma y se unta bien hacia el centro para crear un borde recto paralelo al desprestigio primera caída con una pequeña diferencia de 0,2 mm entre ellos.
- La cámara de diapositivas que contienen las gotas se colocan en la incubadora a 37 ° C durante 2 horas.
- Después de 2 horas, los cultivos se lavaron con DMEM para eliminar no inscritos los desechos celulares y un nuevo soporte de DMEM / FCS al 10% / 1% de fibras discontinuas de poliéster añadió.
Nota: DMEM / FCS al 10% / 1% de fibras discontinuas de poliéster se puede complementar con forskolina (2μM) y el extracto de pituitaria bovina (BPE) (10μg / ml) estimulan la proliferación de células de Schwann. BPE suministrará los factores de crecimiento necesarios para permitir a largo plazo la cultura de células de Schwann y la forskolina eleva los niveles de adenosina cíclico monofosfato en las células de Schwann para inducir la proliferación - Las células se cultivan durante unos 80-10 días a 37 º C, el 7% de CO 2 incubadora. El medio necesita ser cambiada cada 3 días. Los dos frentes de células con el tiempo llegará a los demás y un límite claro se forma entre los dos tipos de células. En esta etapa, los experimentos pueden llevarse a cabo el análisis de los factores que intervienen en la formación de frontera.
- Co-cultivo pueden ser fijas con formaldehído al 4% y las células de Schwann se immunostained con anticuerpos anti-P75 y astrocitos con anti-GFAP anticuerpos para identificar las células en co-cultivo. P75 anticuerpo reconoce receptor de baja afinidad de NGF en células de Schwann que los astrocitos falta. Anti-GFAP anticuerpo reconoce proteína glial firbrillary ácido que se localiza en el citoplasma de astrocitos. (Por favor vea la Figura 1A de frontera representante)
2. La migración del ensayo:
- 4 placas (15 mm de pozos) se PDL cubiertas durante la noche y se preparó para la creación de monocapas de astrocitos.
- La cultura de astrocitos primarios se trypsinized durante 5 minutos con 0,1% de tripsina. Tripsina se inactiva mediante la adición de DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% de fibras discontinuas de poliéster y celular se centrifuga a 300 G durante 5 minutos. (Ver Figura 2)
- Los astrocitos son re-suspendido en el 1x10 5 células / ml. 1 ml de esta solución se añade a cada uno sensibilizados PDL y en 4 placas. Los astrocitos son cultivados durante 24-48 horas hasta que la monocapa es totalmente confluente.
- Para evaluar la migración de células de Schwann en monocapas de astrocitos, en paralelo a la creación de monocapas de astrocitos, circular PDL-cubreobjetos de vidrio recubierto se coloca en un tubo de 50 ml y aplastó con una pipeta de plástico para crear pequeños fragmentos de cristal.
- Fragmentos de vidrio se transfieren a un pozo de seis platos y placa y el uso de fórceps adecuado fragmentos de tamaño se seleccionan y se colocan en otros pozos. 5 fragmentos de vidrio se colocan en cada pocillo en placas de 6 pocillos.
- Primaria las células de Schwann se cultivan en frasco se trypsinized durante 3 minutos con 0,1% de tripsina. Trypsinized células de Schwann se transfieren a separar 15 ml tubo Falcon y se centrifuga a 300 G durante 5 minutos. Las células de Schwann se resuspendieron a 2 x 10 6 células / ml en DMEM/10% FCS / 1% de PSF.
- 20 gotas de L de la suspensión células de Schwann se añade en cada cinco fragmentos cubreobjetos colocado en placas de 6 pocillos y las células se incuban a 37 ° C CO, 7% 2 durante 2 horas.
- Después de 2 horas, las células de Schwann se unen a los fragmentos cubreobjetos y DMEM/10% FCS / 1% de fibras discontinuas de poliéster (Complementado con 2μM de forskolina y 10μg / ml de BPE se añade a cada pocillo de modo que los fragmentos están completamente cubiertos con el medio) .
- El 6 y placas que contienen los fragmentos se colocan en la incubadora durante 24-48 horas hasta que los fragmentos de vidrio son totalmente Confluida con las células de Schwann.
- Una vez que los fragmentos son confluentes con células de Schwann, cada fragmento se recoge con cuidado el uso de fórceps fuerte y se sumerge en HBSS para eliminar las células sueltas y luego la cara invertida hacia abajo sobre monocapa de astrocitos.
- Cada pozo se cubre con 1 ml de DMEM/10% FCS / 1% de las células de Schwann y fibras discontinuas de poliéster se les permita emigrar de 24 a 48 periodo. Durante este período los reactivos experimentales, tales como factores de crecimiento se puede agregar a evaluar su efecto sobre el número y la distancia de la migración de las células de Schwann.
- Tras el período de migración, los fragmentos de vidrio se fijan en la parte inferior de cada pozo mediante la adición de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 30 minutos. Después de la fijación, las células de Schwann inmunotinción para p75 (el reconocimiento de baja afinidad del receptor de NGF) y luego mancha ABC strepavidin kit-diaminobencidina (DAB), para permitir la visualización de las células de Schwann bajo microscopio de luz.
3. Los resultados representativos:
Después de 8-10 días de Schwann, astrocitos co-cultivos muestran un límite claro entre los dos tipos de células. Este límite es más pronunciado si forskolin y BPE se utiliza en la cultura como la proliferación de células de Schwann se ha mejorado.
Si no hay ningún límite se observa durante el período de 10 días, el tiempo de la cultura se puede aumentar aún más hasta los límites establecidos. Cambio de la relación de la densidad celular es una forma alternativa para aumentar la formación de límites. Una proporción de 3:1 de Schwann: densidad celular de astrocitos se pueden utilizar en la preparación de suspensiones de células 8,18.
Después de la inmunotinción para identificar las células de Schwann y astrocitos, células para evaluar una línea de mezcla se pueden sacar en donde el límite está establecido y el número de la migración de las células de Schwann en el territorio de astrocitos se pueden contar bajo el microscopio de fluorescencia.
A continuación se muestran dos ejemplos de imágenes obtenidas fronteras, con una bien formada la segregación de las células de Schwann y astrocitos (Figura 1) y una en la que las células no se han separado y en diferentes territorios, debido a una mala técnica (fig. 1B).
. Figura 1 Límites del ensayo: Schwann, astrocitos interacción. A) con 10 días de co-cultivo de ensayo en presencia de forskolina y BPE para estimular la proliferación de células de Schwann demuestra una frontera clara entre los dos tipos de células (rojo = P75, verde = GFAP). B) A 10 días de co-cultivo de ensayo donde la frontera no se ha formado y los dos frentes de células mixtas. Esto se debió a la mezcla de las dos gotas, mientras que la colocación de las gotas de células de Schwann y astrocitos uno junto al otro durante la preparación de la frontera (rojo = P75, verde = GFAP).
Figura 2. Imagen representativa de la monocapa de astrocitos confluentes
Los ensayos de migración evaluar el movimiento de un tipo de células en la superficie de otro tipo de células y por lo tanto evaluar un fenómeno diferente de la de la formación de frontera.
La práctica es necesaria para asegurar la inversión del cubreobjetos en monocapas no causar daños a la célula de Schwann, cubierta de fragmentos de vidrio y monocapas de astrocitos con las pinzas afiladas. Para evaluar la migración de las células de Schwann, la distancia máxima de la migración y el número de células que migran desde el borde del cubreobjetos se puede medir bajo microscopio de luz.
A continuación se muestra la imagen de las células de Schwann se tiñeron con anticuerpos P75 mediante la tinción de DAB en la superficie de monocapa de astrocitos (Figura 3).
Figura 3. Migración de ensayo utilizando el ensayo cubreobjetos invertido. A) las células de Schwann (marrón, immunostained con anticuerpos p75) migrando desde el borde del cubreobjetos. La flecha apunta a la dirección de la migración de las células fuera del cubreobjetos.
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Discusión
Los ensayos descritos anteriormente se han utilizado en diversos estudios que demuestran el papel de los múltiples factores que intervienen en la formación de frontera entre los Schwann, astrocitos y células de Schwann migración limitada en el entorno de los astrocitos.
Comprensión de los mecanismos que subyacen a estos eventos es fundamental, ya que permitiría el desarrollo de estrategias para optimizar y mejorar la integración de los injertos de células de Schwann después del trasplante y,...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Philippa Warren por su amable ayuda.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolina | Calbiochem | 344273 | |
| Cubreobjetos | VWR international | 631-0149 | |
| Cubreobjetos (rectangulares) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Placas con cámaras | Nalge Nunc international | 177380 | |
| Placas de 4 pozos, placas de 6 pozos | Nalge Nunc international | Placas de 4 pozosPlacas de 6 pozos | |
| Anticuerpo contra p75 de rata | EMD Millipore | MAB365 | |
| Anticuerpo contra GFAP | Dako | Z0334 | |
| Anticuerpos secundarios (conjugados con Alexa) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Anticabra anti ratón 568Anticabre anti conejo 488 |
| Secundario biotinilado | Vector Laboratories | Anticabre anti ratón | |
| Tabletas de DAB | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| Kit ABC elite | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
Referencias
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